cuantificador de proteinas

Métodos para la cuantificación de proteínas: ventajas e
inconvenientes

Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una
técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una
proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una
preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para
otros muchospropósitos.

Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de
estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para
absorber luz en el UV, b) para la formación de derivados químicos, o c) la
capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes. En la Tabla I se
recogen los métodos más usados así como sus respectivas sensibilidades.Cada uno de estos métodos tiene sus ventajas e inconvenientes, las
principales se recogen en la Tabla II.


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Tabla I. Principales métodos para la cuantificación de proteínas y sus rangos de
sensibilidad

Método Rango de sensibilidad
(µg)
Coeficiente de extinción o Cálculo de la
concentración
Métodos de
Absorción
A280
A205
A280 - A260
A235 - A280
A224 -A236
A215 - A225

100-3000
3-100
100-3000
25-700
5-180
2-45


ε280 = 1 mL/mg cm
ε205 = 31 mL/mg cm
Proteína (mg/mL) = (1.55A280 – 0.76A260)
Proteína (mg/mL) = (A235 – A280)/2.51
Proteína (mg/mL) = (A224 – A236)/0.6
Proteína (µg/mL) = 144(A215 – A225)
Métodos Derivados
Colorimétricos

Biuret 1000-10000 ε545 = 0.06 mL/mg cm
Lowry 25-100 a 500 nm
2-30 a660 nm
1-2 a 750 nm
Usar curva estándar
Bradford 1-15 ε595 = 81 mL/mg cm
BCA 0.5- 10 Usar curva estándar
Métodos Derivados
Fluorimétricos

o-ftalaldehido 1-5 λexcitación a 340 nm
λemisión a 475 nm
Usar curva estándar






Tabla II. Principales métodos para la cuantificación de proteínas, principales ventaja e
inconvenientes

Método Ventajas InconvenientesMétodos de
Absorción

No se pierden las
muestras
Interfieren muchos compuestos que absorben
en el UV

Métodos Derivados
Colorimétricos

Biuret Bastante específico para
proteínas
Muestra pocas
interferencias
Es barato
Tiene poca sensibilidad
Lowry Tiene bastante
sensibilidad

No todas las proteínas reaccionan igual
Mustra muchas interferencias comodetergentes no iónicos, sulfato amónico etc.
Bradford Muy sensible Muestra interferencias con detergentes
BCA Es el método mas sensible
Es el que muestra menos
interferencias

Métodos Derivados
Fluorimétricos

o-ftalaldehido Muy sensible La interferencia de aminas contaminantes en
la muestra
No todas las muestras reaccionan igual



2 1.2. Método de Biuret

Sebasa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los
grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con
4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad
de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de
manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy
baja y sólo serecomienda para la cuantificación de proteínas en preparados
muy concentrados (por ejemplo en suero).

1.3. Método de Bradford

Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también
Serva Blue) a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos
formas una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para
formar un complejo proteína-colorante con uncoeficiente de extinción mayor
que el colorante libre. Este método es sensible (1-15 µg), simple, rápido, barato
y pocas sustancias interfieren en su determinación. Entre las sustancias que
interfieren están los detergentes y las soluciones básicas.


1.4. Método de BCA

El ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto capaz de formar un
complejo púrpura intenso con inones...