Cuestionario 2 Estructura Purificaci N De Prote Nas

CUESTIONARIO
PRÁCTICA II. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS

PARTE 1. EXTRACCION Y PRECIPITACION POR SALADO

1. Menciona cuatro usos que se les pude dar a las proteínas purificadas.
Permite la caracterización de la función de una proteína
Permite estudiar la información estructural y determinar las interacciones de la proteína de interés con otras moléculas
Permite entender,concretamente, qué está pasando en la célula y entre las células. Reconstrucción de rutas metabólicas.
Permite estudiar desviaciones del metabolismo normal.
Purificación de enzimas para su uso como biocatalizadores (lipasas, proteasas, glucosa isomerasa), uso en terapéutica (insulina, interleucinas)
Purificación de proteína recombinante, ensayos de transformación genética.
2. Dentro de la guíapara purificar una proteína se plantea que es importante establecer cuál va a ser el uso final de la proteína purificada. Explica por qué.
Para asegurarnos que el desarrollo experimental para la purificación que se planteará será el adecuado, así mismo evitar errores en el procedimiento que puedan afectar la estructura o función de la proteína a estudiar
a) Definir los objetivos de lapurificación.
b) Seleccionar la muestra biológica de inicio.
c) Desarrollar una técnica de análisis.
d) Minimizar la manipulación de la muestra.
e) Remover al inicio del proceso los posibles contaminantes.
f) Reducir el uso de aditivos.
g) Usar una técnica diferente en cada paso.
h) Minimizar el número de pasos.

3. ¿Qué propiedades de la LDH se aprovecharan en cada paso de su purificación? (Ejemplo:carga, peso, solubilidad y unión a ligantes).
El peso molecular: 35 kDa y el punto isoeléctrico: 7.7.


4. ¿Por qué es importante mantener la mezcla de la proteína a 4⁰C?
Generalmente, cuando una mezcla de proteínas se encuentra a una temperatura mayor a 4 °C se presenta ruptura celular.
Con la ruptura celular, se liberan enzimas proteasas que pueden degradar la proteína de interés. Por tanto, esimportante evitar, durante la preparación de la muestra, cualquier actividad proteásica, así como para mantener la integridad de la enzima.
5. De acuerdo con la reacción que cataliza y su función en el organismo, ¿por qué crees que se seleccionó el músculo esquelético de pollo para aislar la LDH?
Debido a que ésta enzima (LDH) participa en el metabolismo anaerobio de la glucosa para laregeneración del ATP, por lo que su actividad es mayor cuando se ejerce una actividad física intensa, por lo que ésta enzima se encuentra en mayor cantidad en corazón y músculo, en sus diferentes isoenzimas. Esto justificaría la selección de esa zona (músculo esquelético) como fuente de interés para obtención de la proteína. En cuanto a la selección fuente del animal, el pollo es relativamente económico encomparación con otras fuentes de proteínas y se trata de una fuente abundante y de fácil acceso.
6. ¿Qué tipo de columna y eluyente recomiendas para su purificación y por qué?
La elección de la columna y eluyente depende de los objetivos que se pretendan alcanzar, los medios y herramientas que se disponen y principalmente dependerá de las propiedades químicas, bioquímicas de la proteína, por loque se deben tener en consideración los puntos anteriores.
Recomendaría una columna por afinidad como parte del proceso de purificación de la enzima LDH, debido a que se puede aprovechar alguna interacción específica con un cofactor, ligando, etc., y esto otorgaría mayor selectividad en la purificación y eliminaría una gran parte de contaminantes y compuestos/proteínas no deseados. Como eluyente,se utilizaría una solución que contenga un amortiguador y pH adecuados para mantener la integridad de la proteína (pI =7.75), que contenga si es necesario un conservador, y el cofactor NADH, que participa en la reacción que cataliza ésta enzima, pero que tampoco llevará a cabo la reacción por lo que se la proteína mantendrá su actividad.
7. Existen varios métodos en la literatura para...