Cultivo de linfocitos de sangre periférica para cariotipo utilizando la técnica de bandas g.

3. CULTIVO DE LINFOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA PARA CARIOTIPO UTILIZANDO LA TÉCNICA DE BANDAS G.

3.1 MATERIALES Y REACTIVOS.

-Medio de cultivo PB MAX TM karyotyping (adicionado con fitohemaglutinina, antibióticos, glutamina).
-Campana de siembra esterilizada con Dermo MR DINE Espuma Antiséptico y Germicida y alcohol.
-Material biológico. Obtener Muestra de sangre periférica 1 ml,aproximadamente; con jeringa estéril heparinizada.

Nota: En caso de que se utilice el medio Mc COY preparar lo siguiente:
Mc COY 100 ml
Antibiótico y antimicótico 1 ml
Fitohemaglutinina (PHA) 2 ml
Sangre del paciente 0.3- 0.5 ml

NOTA: Solo se podrá realizar la toma de muestra para cariotipo los días lunes, martes y viernes, de preferencia de 7:00a.m. a 9:00 a. m., debido a las 72 horas de incubación que requieren las muestras.
3.1.1 TOMA DE MUESTRAS PARA CARIOTIPO
Los pacientes se deben presentar sin estar recibiendo ningún tipo de terapia farmacológica, radioterapia, transfusiones o tener un cuadro infeccioso.
Se utiliza material estéril y desechable para obtener la muestra sanguínea por punción venosa.
Los pacientes que nocumplan con estas condiciones serán citados nuevamente.



3.1. 2 PROCEDIMIENTO
Alicuotar el medio de cultivo en tubos de ensaye estériles. Colocar 5 ml en cada tubo y etiquetar cada tubo de ensaye con el medio indicando el nombre del medio, la fecha de alícuota y lote. Mantenerlos en el refrigerador hasta el tiempo de sembrar las muestras.
Al momento de sembrar:
Etiquetar dos tubos de ensayecon medio por cada paciente.
En condiciones estériles, agregar a cada tubo 0.9 ml de sangre y etiquetar cada tubo con el numero del respectivo paciente.
Invertir suavemente el tubo para mezclar la sangre.
Incubar las muestras sembradas en la incubadora a 37ºC durante 72 horas.
3.2 COSECHA Y FIJACIÓN DE CÉLULAS.
3.2.1 MATERIALES Y REACTIVOS.

Colcemid (Karyo MAX® Colcemid ®Solution 10 µg/ mL).
Solución hipotónica 0.075 M:
KCl 2.796 g
Agua destilada 500 ml
Solución de Carnoy:
Metanol 75 ml
Ácido acético glacial 25 ml
3. 2. 2 PROCEDIMIENTO
A las 71 horas agregar 0.3 ml de Colcemid a cada tubo deensaye y dejar incubar 1 hora.
Transcurrido este tiempo, se centrifugan durante 10 minutos a 1500 rpm.
Se retira el sobrenadante, se resuspende el paquete celular y se adicionan 10 ml. de Solución hipotónica previamente caliente a 37ºC, se resuspende nuevamente y se incuban por 30 minutos a 37ºC.
Centrifugar durante 10 minutos a 1500 rpm.

Extraer el sobrenadante, se resuspende el paquetecelular y se adicionan 8 ml. de Solución de carnoy; agitar por inversión y centrifugar durante 10 minutos a 1500 rpm.
Extraer el sobrenadante, se resuspende el paquete celular y se adicionan 8 ml. de Solución de carnoy; agitar rápidamente por inversión y centrifugar durante 10 minutos a 1500 rpm.
Se aspira el sobrenadante, nuevamente, se resuspende el paquete celular y se adicionan 8 ml. de Soluciónde carnoy; agitar por inversión y centrifugar durante 10 minutos a 1500 rpm. Este paso se repite hasta que el sobrenadante quede transparente. Los tubos pueden mantenerse por largo tiempo en refrigeración.
Realizar las preparaciones.
3 PREPARACIÓN DE LAMINILLAS.
3. 3. 1 MATERIALES.
Usar portaobjetos prelavados con agua destilada y dejar en refrigeración dichas laminillas con una solución demetanol y agua destilada al 50%.
3. 3. 2 PROCEDIMIENTO
Para hacer las preparaciones, se elimina el sobrenadante dejando solo aproximadamente 1 ml de fijador.
Resuspender el paquete celular con una pipeta pasteur.
Se toma con una pinza un portaobjeto limpio, frío y húmedo se pasa por el mechero y dependiendo de la concentración del botón celular y colocando el portaobjetos de forma...