cultivo de tejidos vegetales

PROTOCOLO #2
INDUCCIÓN DE BROTES ADVENTICIOS A PARTIR DE HOJAS Y PECIOLOS DE VIOLETA AFRICANA (Saintpaulia sp.)
INTRODUCCIÓN
Un buen ejemplo del proceso de organogénesis es la formación de brotes adventicios utilizando hojas y peciolos de violeta africana. La producción de brotes ocurre en células somáticas que pierden su diferenciación celular y posteriormente se reorganizan para adquirir sucapacidad meristemática por efecto de los fitoreguladores y de los gradientes nutritivos dentro del tejido. La organogénesis es regulada por el balance citocinina/auxina, de tal modo que una alta proporción de citocininas estimula la formación de brotes, mientras que el incremento en la concentración de auxinas induce la formación de raíces. Para que este proceso ocurra es importante considerarla planta donadora, los fitoreguladores, el medio de cultivo y las condiciones ambientales.

MATERIAL
Soluciones stock de medio MS
Soluciones stock de fitohormonas (citocinina BA y auxina ANA).
64 frascos Gerber® para siembra de explantes.
Pinzas de disección, espátulas y bisturí (previamente esterilizados).
8 vasos de precipitados de 250 mL
Vaso de precipitados de 2000 mL
Parrilla deagitación magnética y calentamiento
Barras magnéticas para agitación (moscas)
Probetas de 50, 20 y 200 mL
2 pipetas graduadas de 1 mL
Marcador de tinta indeleble y masking tape para etiquetar
Charolas de pesado
Cajas petri esterilizadas
Frasco vacío y frascos con agua destilada esterilizados.
Tapas de polipropileno o cuadros de papel aluminio con ligas
Autoclave
Guantes de cocina paramanejar objetos calientes
1 violeta africana con abundante follaje
Detergente líquido Dawn®
Etanol al 70% (v/v)
Hipoclorito de Sodio NaOCl al 20%
Detergente Tween 80®
Campana de flujo laminar, o mecheros Bunsen para crear un área aséptica para la siembra.
Agua destilada esterilizada

MÉTODOS
Se realizará un “barrido homonal” con la combinación de diferentes concentraciones de citocinina yauxina, como se indica en la Tabla 1.

Tabla 1. Combinación de tratamientos con diferentes concentraciones de citocinina y auxina para la inducción de brotes adventicios (barrido hormonal)

0
0.5 mgL-1 (mg/L)
1 mgL-1 (mg/L)
5 mgL-1 (mg/L)
0
0/0
0.5/0
1/0
5/0
0.1 mgL-1 (mg/L)
0/0.1
0.5/0.1
1/0.1
5/0.1

Es recomendable realizar el barrido hormonal para conocer la concentracióno combinación óptima para el desarrollo de brotes en el explante. Se utilizará el medio MS adicionado con la citocinina BA combinada con la auxina ANA, además del testigo (sin fitoreguladores), haciendo un total de 8 tratamientos.
Por cada tratamiento se utilizarán 8 frascos (repeticiones) y a cada uno se le agregaran 25 mL del medio, por lo que para cada tratamiento se prepararán 200 mL demedio MS. Por lo tanto se requieren de 1600 mL de medio MS.

a) Elaboración de medio MS + BA/ANA para el cultivo de violeta africana.
Poner 1 L de agua destilada en un vaso de precipitados de 2 L.
Agregar, en el orden indicado, las alícuotas calculadas de soluciones stock mezclando perfectamente antes de incorporar la siguiente (Tabla 2). Usar la parrilla y las barras de agitación magnética.Pesar y agregar la sacarosa. Agitar hasta que se disuelva.
Aforar el medio a 1400 mL y repartir 175 mL en cada uno de los 8 vasos de precipitados de 250 mL.
Anotar en cada vaso la combinación de citocinina/auxina que corresponda (ejemplo: 0/0, 0.5/0, 1/0, 5/0, etc.)
Con la ayuda de las pipetas agregar los reguladores de crecimiento (Tabla 3). Para evitar la contaminación, utilizar pipetasdiferentes para cada solución stock. Mezclar.
Ajustar el pH a 5.7 – 5.8 con HCl y/o KOH 0.5 N.
Con una probeta, aforar cada tratamiento a 200 mL. Regresar el medio al vaso de precipitados y cubrirlo con película plástica adherible para evitar que se evapore.
En la parrilla calentar el medio (60 a 70°C) en agitación constante.
Pesar 1.6 g de agar bacteriológico por cada 200 mL de medio....