cultivo de tejidos

PROTOCOLO #1
PREPARACIÓN DE MEDIO DE CULTIVO PARA TÉCNICAS DE CTV
INTRODUCCIÓN
El Cultivo de Tejidos Vegetales (CTV), también llamado cultivo in vitro, comprende un conjunto de técnicas donde protoplastos, células, tejidos, órganos, embriones, plántulas o pequeñas secciones de tejido de una planta donadora, son cultivados libres de gérmenes (asépticamente) en medios nutritivos. Estos cultivosson mantenidos en condiciones ambientales controladas de temperatura y luz (fotoperiodo e intensidad luminosa).
El CTV se basa en la Teoría Celular (Schleiden y Schwann, 1838-1839) que dice que cada célula, al contener toda la información genética necesaria, es capaz de formar un nuevo individuo completo si se le proporcionan las condiciones adecuadas (totipotencialidad celular).
El éxito delas técnicas dependerá del medio de cultivo empleado así como del tipo de tejido seleccionado. Los requerimientos nutritivos de los tejidos son proporcionados por los ingredientes del medio, constituido por compuestos inorgánicos (macro y micro elementos); compuestos orgánicos (sacarosa, vitaminas, aminoácidos y fitoreguladores, principalmente aquellos que promueven el crecimiento y otros procesosfisiológicos, tales como las auxinas y las citocininas); y complejos naturales (jugo de frutos y agua de coco inmaduro), empleados para enriquecer el medio cuando los ingredientes químicamente definidos no han sido eficientes para el establecimiento del cultivo. El pH del medio está relacionado con la disponibilidad y la absorción de los nutrientes; así como, con la gelificación del medio; elrango más utilizado fluctúa entre 5.5 a 5.8 y se recomienda medirlo con un potenciómetro.
Los medios pueden ser líquidos y requerir agitación continua para mantener la oxigenación y la distribución homogénea de los nutrientes, o semisólidos utilizando agar como material de soporte.
Se han formulado diversos medios de cultivo, uno de los más empleados es el de Murashige y Skoog (1962) llamado “MS”,que se caracteriza por su alto contenido en nitrógeno y potasio.
OBJETIVO
Preparar medio de cultivo MS que se empleará para desarrollar diferentes técnicas del CTV.

MATERIAL
a) Preparación de soluciones stock
Materiales para la preparación del medio
Pisetas
Espátulas
Recipientes para pesar los reactivos (charolas de pesado)
Balanza analítica
Parrilla de agitación magnética ycalentamiento
Barras magnéticas para agitación (moscas)
Vasos de precipitados (5, 100, 250, 1000 y 2000 mL)
Probetas para aforar (100 y 200 mL)
Pipetas (1 y 5 mL)
Potenciómetro
Película plástica adherible tipo Ega-Pack®

Matraz aforado (50 mL)
Frascos transparentes y frascos ámbar, con tapón esmerilado (50, 100 y 200 mL)
Masking tape para etiquetar
Marcador de tinta indeleble
AutoclaveGuantes de cocina para sujetar objetos calientes
Cinta testigo
Hojas de papel aluminio grueso de 10 x 10 cm y ligas
Agitadores de vidrio

Reactivos para la preparación del medio:
Agua destilada
Fitoreguladores (citocinina/auxina): Benciladenina (BA) / ácido naftalenacético (ANA)
HCl 0.5 N para ajustar el pH y disolver citocinina
Etanol absoluto para disolver auxina
KOH 0.5 N
Frascosgotero para soluciones de KOH y HCl 0.5 N
Sacarosa (se puede sustituir por azúcar refinada)
Agar bacteriológico (Bioxon®)

MÉTODOS
a) Preparación de soluciones stock
Preparar por separado cada una de las soluciones stock. Para evitar la contaminación de los reactivos, pesarlos con espátulas diferentes, o bien limpiarlas después de cada uso.
Pesar las cantidades (10x) que se indican en laTabla 1 y disolver, en agitación constante, en una cantidad de agua destilada menor al volumen final de la solución. Para cada una de las soluciones, agregar los compuestos en el orden indicado y añadir el siguiente hasta que se disuelva completamente el anterior, de esta forma se evitara la precipitación de los compuestos.
Aforar cada una de las soluciones al volumen señalado.
Vaciar cada...