Cultivo in vitro de plantas

“PRÁCTICAS DE CULTIVO IN VITRO DE PLANTAS”
RESUMEN
En esta práctica trataremos de realizar un cultivo in vitro de lavanda a partir de fragmentos de tejido vegetal ya existente.
Cogeremos untejido vegetal de lavanda y se colocará en la placa petri con un medio de cultivo previamente preparado con objetivo de realizar la inducción de un callo de cultivo.
Una vez obtenido, se pasa a unmatraz para que se desarrolle y libere ácido rosmarínico, que obtendremos mediante las técnicas de análisis HPLC y TLC.
MATERIAL Y MÉTODOS
Material
1 matraz
1 placa de Petri
3 pipetas de vidrio (1mL, 5 mL, 10 mL)
Ácido clorhídrico 1%
Agua destilada
Alcohol desinfectante
Algodón
Básculas de pesaje
Bisturí
Cabinas de flujo laminar
Carbonato 6%
Domestos (lejía “Estrella”)
Espátulas
FolinHojas de lavanda
Mechero bunsen
Medidor de pH
Medio de cultivo Murashige-Skoog
Hidrolizado de caseína
Vitaminas de Morel
Kinetina (200 mg/L)
2,4-D (200 mg/L)
Sacarosa
Agar 0,8%
Metanol(MetOH) 80%
Micropipetas
Papel albal
Parafilm
Pinzas
Propipetas
Tubos de ensayo
Vaso de vidrio
Métodos
Día 1 – Preparar medio de cultivo en condiciones estériles
Se prepararán 200 mL de mediode cultivo empleando:
Murashige-Skoog de 1962 → 0,8604 M
Hidrolizado de caseína → 0,05 g
Vitaminas de Morel →0,2 mL
Kinetina (200 mg/L) → 0,5 mL
2,4-D → 1 mL
Sacarosa → 6 g/L
Utilizamos labáscula de pesaje para medir los compuestos sólidos y las pipetas y micropipetas para medir los compuestos liquidos.
Tras mezclar todos los componentes en un vaso de vidrio, realizamos una medida del pH,ya que éste tiene que ser próximo a 6. Esta medición hubo que realizarla antes de incorporar el agar ya que éste interfiere con el electrodo y no se podría ajustar correctamente el pH.
Tras ajustarel pH a 6 se pasa la mezcla a un matraz, al que se añaden 1,6 g de agar y se guarda en un autoclave para mantener una temperatura elevada, ya que a temperatura ambiente el agar no se disuelve....