Dante en el infierno

EL ADN RECOMBINANTE SE FORMA DE EMPALMAR ADN DE UN VECTOR

La mayor parte de las moléculas de ADN recombinante se aíslan y amplifican al introducirlas en las células de la bacteria E coli. Para aislar un fragmento específico de ADN después de que ha sido cortado por una enzima de restricción, ese fragmento debe ser incorporado antes en un portador adecuado, o molécula vectora.

Como vectorsuele emplearse el ADN de bacteriófagos o moléculas de ADN especiales llamadas plásmidos. El ADN es bacteriano es circular, un plásmido es una molécula separada mucho más pequeña que el ADN circular que puede estar presente y es capaz de duplicarse dentro de una célula bacteriana. Estos plásmidos pueden aislarse de células por un método denominado transformación lo cual implica modificar lapared celular bacteriana para hacerla permeable a las moléculas de ADN del plásmido.

Los plásmidos que usan en la actualidad en el trabajo con ADN recombinante han sido “manipulados” de manera considerable para que incluyan varias características que ayuden al aislamiento y al análisis del ADN clonado.

FORMACION DE LA MOLECULA DEL ADN RECOMBINANTE

Consiste en la unión covalente invitro, del inserto de ADN al vector fragmentado, mediante una ligasa. La especificidad de la unión depende del tipo de extremos que hayan resultado al preparar el inserto y el vector. Si son cohesivos, su secuencia es la específica de la enzima de restricción empleada y solo se asocian los extremos compatibles; una vez asociados por apareamiento de bases, la ligasa establece la unión covalentesellando las dos mellas. Si se trata de extremos romos, no pueden asociarse, pero la ligasa puede unir, aunque con menos eficacia, y no supone ninguna diferencia en la enzima de restricción con la que se prepararon.

TIPOS DE VECTORES

Los vectores empleados para la clonación de insertos de ADN son muy variados. Pueden clasificarse según varios criterios, como:

---Su procedencia procarioticao eucariotica

---El tipo de molécula a partir de la que se separan:

Plásmidos: bacterianos, de levadura o de plantas

Virus: que infectan bacterias, plantas, invertebrados o vertebrados

Cromosomas artificiales: derivados de elementos cromosómicos de fagos, de bacterias o de levaduras

Quimeras, es decir, moléculas formadas combinando partes de otras cuyo origen es diferente

--- Eltipo de célula anfitriona en la que el ADN recombinante resultante se puede luego incorporar

--- El gen de resistencia que contiene el vector para su posterior detección o selección

--- El tamaño del ADN que admiten como inserto

PLASMIDOS

Son moléculas de ADN de doble hebra de pequeño tamaño (2-5kt) y forma circular, presentes en forma libre en citosol de muchas bacterias y de algunoseucariotas unicelulares. Son fáciles de purificar a partir de un cultivo bacteriano permiten la incorporación de insertos de ADN de un tamaña máximo de unas 10 kb.

INCORPORACIÓ DEL ADN RECOMBINANTE A LA CELULA ANFITRIONA

La replicación de las moléculas de rDNA (clonación) requiere que estas se introduzcan en la célula anfitriona. Para que esta incorporación, que en general tiene lugar amecanismos poco conocidos, sea eficaz es preciso emplear células especializadas, adecuadas al vector de clonación utilizado y con capacidad de clonación.

INSERTOS DE ADN

Se parte de células nucleadas, normalmente sanguíneas. Lisadas por sonicación o por suspensión en un medio hipotónico. Una vez eliminadas las moléculas acompañantes, tanto RNA como proteínas y enzimas o fragmentosproteolíticos, se precipita y concentra el ADN. Este posteriormente se fragmenta en enzimas de restricción, para dar lugar a una mezcla cuyo contenido, en número y tamaño de fragmentos, depende del número de sitios de restricción y de su accesibilidad para las enzimas. El fragmento que se va a clonar debe aislarse, o separarse del resto, mediante alguna técnica adecuada como la electroforesis en gel de...