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38. Purificación de ADN plasmídico y
electroforesis del mismo en gel de agarosa
José Luis Caballero Repullo, Enriqueta Moyano, Juan Muñoz
Blanco
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba

RESUMEN

Los plásmidos son moléculas pequeñas de ADN circular muy comunes en
bacterias que se replican de modo autónomo eindependiente del
cromosoma de la célula. Constituyen una herramienta fundamental en
Biología Molecular e Ingeniería Genética ya que se pueden usar como
“vectores” para introducir en ellos cualquier fragmento de ADN de interés
y de esta forma amplificarlo (es lo que se llama “clonar” un fragmento de
DNA). La obtención de grandes cantidades de ADN puro de estos
“vectores” es fundamental enaplicaciones posteriores. En esta práctica
se realizará el aislamiento y purificación de un ADN plasmídico mediante
la utilización de un “kit” de uso rutinario en laboratorios de Biología
Molecular. Posteriormente se visualizará mediante electroforesis en gel
de agarosa.
Palabras clave: agarosa, aislamiento, lisis, plásmido, UV, vector
Abreviaturas empleadas. ADN: ácido desoxirribonucleico;EtBr, bromuro de
etidio; UV: luz ultravioleta.

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
Los plásmidos son moléculas pequeñas de ADN circular capaces de
replicarse de forma autónoma, independientemente del cromosoma. Son muy
comunes en bacterias y algunos de ellos, los más pequeños, existen en las
células bacterianas en un número elevado (hasta 100 copias por célula). Los
plásmidos son una herramientafundamental en Biología Molecular e Ingeniería
Genética ya que se pueden usar como “vectores” para introducir en ellos
cualquier fragmento de ADN de interés y de esta forma amplificarlo de forma
natural dentro de la bacteria en la que el plásmido se replica (es lo que se
llama “clonar” un fragmento de DNA). Existen muchos plásmidos disponibles
para usar con este fin y la mayoría contienen almenos los siguientes
elementos:
-Un origen de replicación autónomo para E. coli (ej. ColE1) que permite la
replicación autónoma en esta bacteria.
-Un gen que confiere a la bacteria portadora del plásmido resistencia a algún
antibiótico, generalmente ampicilina.
-Un sitio de clonación múltiple en el que se encuentra dianas únicas para
varias enzimas de restricción y que permite la introduccióndel ADN a clonar.

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Un método que permite visualizar ADN plasmídico o fragmentos del mismo
es la electroforesis en gel de agarosa, en la cual se separan en función de su
tamaño. Esta técnica consiste en someter la mezcla de moléculas de ADN
embebidas en un gel de agarosa a un campo eléctrico. Las moléculas de ADN
son atraídas al polo positivo debido a la carga neta negativa de ambascadenas
consecuencia de sus grupos fosfato. Las moléculas más pequeñas migran más
rápido que las grandes al verse menos “frenadas” por el gel de agarosa en su
desplazamiento. Cuando los fragmentos se han separado, el gel se sumerge
en una solución que contiene bromuro de etidio y luego se ilumina con luz UV.
El bromuro de etidio (EtBr) es una molécula plana con afinidad por el ADN que
seintercala entre las pares de bases y que tiene la particularidad de que
fluoresce cuando está unido a él. Al iluminar el gel con luz UV se ven bandas
de fluorescencia que corresponden a moléculas de ADN.
La obtención de altas cantidades de ADN plasmídico puro es fundamental a
la hora de analizarlo o utilizar a éste como vector en aplicaciones posteriores.
El avance de la ingeniería genética y delas técnicas de ADN recombinante ha
supuesto un aumento del número y variedad de técnicas de purificación de
ADN. En comparación con métodos tradicionales (que utilizan fenol u otros
reactivos tóxicos), los nuevos métodos utilizan reactivos no peligrosos,
mientras que mantienen un alto rendimiento y pureza del producto final. El
objetivo de esta práctica es el aislamiento y purificación de...