desarrollo experimental

Introducción
La técnica ELISA (ensayos de inmune absorbencia ligada a enzimas) se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción marcada enzimáticamente cuyo producto, puede ser medido espectrofotométricamente. La cantidad de antígeno se determina comparando la curva estándar generada con cantidadesconocidas del antígeno. 
El ensayo inmune absorbente ligado a enzimas (ELISA) utiliza como sus siglas lo indican una enzima como marcador para mediar la formación de complejos antígeno-anticuerpo .Existen diversas variaciones al método de ELISA para detectar y cuantificar ligando de alto peso molecular, el marcador enzimático que se emplea en estos análisis se conjuga con un ligando, que puedeser un antígeno, un anticuerpos específico para el antígeno de interés o un anticuerpo para el anticuerpo primario.
Casi todas las pruebas ELISA son ensayos en fase sólida en los cuales se adsorbe un antígeno o un anticuerpo sobre un soporte sólido. Algunos de los protocolos se basan en reacciones de enlace competitivo y otras en reacciones de enlace no competitivo, pero en todas las pruebas ELISAse requiere de un paso de separación para eliminar el conjugado enzimático libre antes de proceder a determinar la cantidad de conjugado enzimático enlazado. Para lo cual se añade sustrato enzimático y se mide la reacción catalítica entre la enzima y el sustrato. Por sus características catalíticas las enzimas son marcadores muy sensibles y versátiles.
Una sola proteína enzimática puedetransformar en algunos minutos gran número de moléculas de sustrato en una cantidad igualmente abundante de producto final, produciendo un cambio de color amplificado y que se detecta con facilidad. En el método ELISA de inhibición el cambio de color se reduce, porque la actividad enzimática se inhibe cuando el anticuerpo se enlaza al conjugado enzimático.
Por otro lado, el western blot o inmunoblot, esuna técnica desarrollada en el laboratorio de George Stark, en la Universidad de Standford. Consiste en una técnica analítica que permite detectar y cuantificar proteínas específicas en una muestra determinada, muestra que generalmente contiene una gran variedad de proteínas, de las cuales solo algunas serán de interés. Las proteínas a estudiar deben estar libre de contaminantes, para ello y antesde realizar el inmunoblot, se deben aislar y purificar. El western blot, se basa principalmente en la capacidad de unión de estas proteínas a anticuerpos específicos.
Las proteínas se separan mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes, SDS-PAGE, para luego ser transferidas a una membrana adsorbente (nitrocelulosa o de PVDF), mediante una aplicación de uncampo eléctrico perpendicular al gel (electroblotting). Esta etapa permitirá buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella, estos anticuerpos pueden ser policlonal o monoclonal; o unidos a enzimas específicas para la proteína estudiada.
Como resultado, los investigadores pueden examinar la cantidad de proteínas en una muestra y comparar los niveles de presencia entrevarios grupos. 



Desarrollo
La técnica ELISA detecta o mide la cantidad de proteína de interés en una muestra que puede contener otras muchas proteínas diferentes. Utiliza un anticuerpo para ligar la proteína específica, un segundo anticuerpo para amplificar la detección (fase optativa) y un conjugado de anticuerpo con una enzima, cuyo producto genera una reacción coloreada, que es fácil deobservar y cuantificar comparando con una curva patrón de la proteína de interés.
La prueba ELISA se basa en varias teorías: 1)El antígeno y anticuerpo pueden enlazarse a una superficie portadora insoluble y retener su reactividad inmunológica;2)las enzimas tienen actividad específica alta y convierten una cantidad relativamente grande de sustrato en producto detectable, lo que permite detectar...