deshidratacion, aclaramiento e inclusion

Desidratacion, aclaramiento e inclusión



DESHIDRATACIÓN
Desde el fijador (a la izquierda) la muestra es colocada sucesivamente en concentraciones crecientes de alcohol.
Luego de la deshidratación total en alcohol 100%, el siguiente paso es la aclaración o diafanización.
Lamentablemente la parafina no es soluble en el alcohol 100% y por lo tanto se utiliza una sustancia intermedia(soluble en alcohol 100% y en parafina). Antes de incluir la muestra en parafina se extrae el alcohol 100% mediante el uso de xilol. Este compuesto altera el índice de refracción de la muestra y la torna ligeramente translúcida. Debido a este hecho este paso de la técnica histológica se denomina ACLARAMIENTO.
 

ACLARAMIENTO
Desde el alcohol absoluto (100%) la muestra es aclarada en xilol
Una vezque la muestra ha sido totalmente embebida por el xilol (aclaramiento) se transfiere a un baño de parafina derretida dentro de una estufa. La estufa es mantenida a 58 grados centígrados (el punto de fusión de la parafina es 56-57 grados) y la muestra es transferida a través de tres baños sucesivos de parafina. De esta forma la parafina caliente desplaza al xilol y difunde dentro de la muestra otejido. A este paso se lo denomina INCLUSION EN PARAFINA.

INCLUSION
Estufa a 58 grados con los tres baños de parafina (wax en inglés).
Luego de la INCLUSION en parafina se saca la muestra con la parafina y se la coloca en un molde metálico donde se orienta la muestra antes de que se enfríe la parafina.
 

Observe los moldes de metal y los bloques solidificados de parafina que incluyen lamuestra fijada.
Ahora si, ya tenemos la muestra incluida en un medio rígido que nos permitirá realizar cortes o secciones sumamente delgados. El siguiente paso de la técnica histológica es la sección.

INCLUSION
Una vez fijado el tejido tenemos que procesarlo para su observación con el microscopio. Ello implica hacer secciones para teñirlas primero y posteriormente observarlas. Como reglageneral se procede al endurecimiento de la muestra para poder obtener dichas secciones ya que lo normal es que cuanto más delgada queramos una sección más consistente debe ser la muestra de la que se obtiene. Los tejidos se endurecen a consecuencia de la fijación, pero ésta no es muy alta e impide la obtención de cortes generalmente más delgados que 20 o 30 µm. Sólo en el caso de que queramostrabajar con secciones relativamente gruesas (entre 30 y 200 µm) se puede aprovechar el endurecimiento provocado por el fijador y obtener dichas secciones con el vibratomo, que se utiliza en ciertas técnicas donde es necesaria una buena preservación molecular. Sin embargo, en muchos casos necesitamos endurecer más el tejido para obtener secciones más finas y se puede hacer de dos formas: congelación einclusión.
La congelación de los tejidos previamente fijados permite la obtención de secciones que pueden ir desde unas 50 µm hasta nm, para lo que se utilizan diferentes aparatos: microtomo de congelación para secciones de decenas de µm, criostato para secciones de entre 5 y 20 µm y ultracriotomo para secciones ultrafinas del orden de nm. Para evitar los daños que se producen durante los procesosde congelación, formación de cristales de hielo que nos agujerean los tejidos, se han de tener en cuenta dos procesos: a) Anticongelantes que impidan la formación de cristales. El crioprotector más usado es la sacarosa al 30 %, aunque también se usa el dimetil sulfóxido, el glicerol, etilén glicol y otros. La elección de uno u otro depende del tipo de muestra y de la técnica que se vaya a usar.b) Una congelación lo más rápida posible, por ejemplo, con nitrógeno líquido. Cuanto más rápida es la congelación menores son las dimensiones de los cristales de agua formados.

Se pueden obtener secciones de grosor variable utilizando diferentes métodos. Secciones más finas se obtienen endureciendo más el tejido. Esto se puede conseguir mediante la congelación o embebiendo el tejido en...