Desnaturalizacion De La Cromatina

¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes? Southern, Northern y Western Blot?
Existen diferentes técnicas que emplean la separación en gel por electroforesis como primer paso paraidentificar la presencia de determinadas moléculas dentro de una muestra. Una de ellas fue inventadapor Edward M. Southernen 1975 para la detección de ADN. Una vez finalizada la corrida en el gel, serealiza latransferencia (o blotting) de las muestras a una membrana para su posterior revelado. Luegose utilizó el mismo sistema para detectar ARN y se lo denominó Northern Blot (en clara alusión alnombre del científico inventor de la técnica basada en ADN).Estas dos técnicas consisten en una electroforesis seguida de transferencia y emplean secuenciasespecíficas (sondas) complementarias a la molécula de ácidonucleico a identificar. Es decir, ambasutilizan la hibridación de ácidos nucleicos para la detección de las moléculas buscadas. Los principiosgenerales son los mismos, pero hay diferencias en el procedimiento debidas principalmente a que elARN se degrada mucho más fácilmente que el ADN; esto hace necesario tomar muchas másprecauciones.Una vez sembradas las muestras en un gel, se realiza una corridaelectroforética hasta lograr que lasmoléculas se separen por tamaños de manera tal que se puedan distinguir las buscadas. Luego setransfieren los ácidos nucleicos del gel a la membrana. De esta manera los que quedan retenidospueden ser sometidos a ensayos de hibridación con sondas específicas para detectar la presencia dedeterminadas secuencias.Estas dos técnicas persiguen fines distintos: elSouthern Blot, que detecta la presencia de ciertassecuencias en el ADN, se usa, por ejemplo, para estudiar mutaciones en el genoma. El Northern, encambio, permite detectar qué genes son transcriptos en determinadas condiciones. Hemos visto quedos células del mismo organismo se distinguen por los genes que expresan y no por su ADN. El SouthernBlot nos permite evidenciar el mismo material genético y elNorthern Blot, la expresión de diferentesgenes.Si luego queremos detectar proteínas, usaremos otra técnica similar: el Western Blot, que deriva de laelectroforesis en gel y separa proteínas mediante la utilización de anticuerpos específicos. Una vez quela muestra con las proteínas que se quiere identificar ha corrido en un gel, se la transfiere a unamembrana especial donde las proteínas quedan“ancladas” o adheridas. Después, se incuba estamembrana con el anticuerpo específico contra la proteína blanco, y se revela. Con esta técnica puedenobtenerse datos aproximados del tamaño de la proteína y su concentración en la muestra sembrada.
Southern Blot:
La técnica consiste en cortar el DNA con enzimas de restricción para producirfragmentos de diferente tamaño. Los fragmentos se separan por sutamaño molecular medianteelectroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio (Rybicki y Purves, 1996). Losfragmentos son luego transferidos a una membrana que actúa como filtro. Para ello el gel se sumergeen una solución salina para denaturarlo a hebras sencillas. Las hebras se adhieren al papel secante quelas recibe y acepta debido a sus propiedades químicas. Después los fragmentosse fijan (por UV) alfiltro membranoso y pueden ser hibridados con una sonda que se marque radioactivamente y que tengauna secuencia complementaria a la del fragmento en cuestión. Después de la hibridación, se lava elfiltro y los fragmentos se detectan por radioautografía o mediante fluorescencia (en caso de marcajeno-radioctivo).
Southern Blot
El Southern Blot es una técnica que permite laidentificación de secuencias específicas de DNA,mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridación utilizando sondas especificas.Para analizar una muestra de DNA cromosomal ésta debe ser previamente fragmentada, por ejemploutilizando sonicación ó enzimas de restricción.Los fragmentos obtenidos se separan, de mayor a menor tamaño mediante una electroforesis en gel deagarosa. Una vez terminada...