DETECCI N DE LA PROTE NA SSTR2 MEDIANTE WESTERN BLOT
Páginas: 14 (3392 palabras)
Publicado: 19 de julio de 2015
DETECCIÓN DE LA PROTEÍNA SSTR2 MEDIANTE WESTERN BLOT.
Fundamento teórico
Entre las diversas metodologías que nos permiten tener un acercamiento a la Biología celular, la metodología denominada Western Blot es una de las que nos brinda una gran cantidad de información, adaptándose a laboratorios de investigación, así como a laboratorios de diagnóstico médico.
Las proteínas pueden serconvenientemente separadas, en función de sus pesos moleculares, gracias a diversas técnicas electroforéticas. Sin embargo a veces es necesario constatar la presencia de una proteína en especial. Para cumplir éste objetivo conjugamos el poder resolutivo de la electroforesis de poliacrilamida, con la especificidad de un anticuerpo en el reconocimiento de un antígeno proteico.
En líneas generales laaproximación del Western blot nos permite el reconocimiento de una fracción proteica, cuya presencia puede servir para estudiar (por ejemplo) la expresión proteica en un sistema biológico (por ejemplo cultivo celular) o bien está relacionada a antígenos bacterianos o virales. Así la metodología del Western blot es la técnica confirmatoria para el diagnóstico de la infección por el virus HIV.
Lasproteínas presentes en un dado extracto son separadas mediante SDS-PAGE. Luego de ello las bandas proteicas del gel son transferidas a una membrana de nitrocelulosa (por capilaridad o bien aplicando un campo eléctrico) y finalmente ésta membrana es puesta en contacto con un anticuerpo específico. Dicho anticuerpo reconocerá epitopes presentes en la proteína de interés, y posteriormente será reconocido porotro anticuerpo (anticuerpo secundario, capaz de reconocer la porción Fc de las inmunoglobulinas) marcado con alguna molécula que permita luego la detección (por ejemplo biotina-estreptavidina o sistemas quimioluminiscentes) del conjunto.
Desarrollando la metodología del Western Blot
Para llevar adelante éste procedimiento de gran utilidad en el reconocimiento específico de fracciones proteicasde interés requeriremos conocer los elementos con que trabajaremos:
1) Muestra: Extracto proteico
El paso fundamental para poder aplicar la tecnología del Western blot es contar con la muestra. Ésta muestra estará constituida por el extracto obtenido del sistema bajo estudio mediante lisis celular.
2) Cuantificación del extracto
Una vez obtenida la muestra, ésta debe ser cuantificada. Esimportante conocer la cantidad sembrada en los geles para asegurarnos que podremos luego efectuar comparaciones.
3) SDS-PAGE
Tras la cuantificación del extracto (en caso de ser necesario) se debe realizar un SDS-PAGE, con el cuidado de sembrar en cada pocillo la misma cantidad de proteínas.
La electroforesis se detiene cuando el frente de corrida alcance la migración apropiada y se quita el gel delsistema. Posteriormente se equilibra el gel en tampón de transferencia para seguir adelante con el procedimiento.
4) Transferencia
La corrida electroforética (con todas las bandas proteicas separadas) será transferida a una membrana de nitrocelulosa. No observaremos ninguna banda o color en el gel migrado, excepto el del frente de corrida.
Equilibraremos el gel migrado así como papeles defiltro y esponjas delgadas cortadas al tamaño del gel en Tampón de Transferencia. Dicho tampón tiene como base al mismo tampón de migración de la SDS-PAGE con el agregado de metanol, que facilitará la transferencia proteica a la nitrocelulosa.
La transferencia puede llevarse a cabo por capilaridad (colocando capas de papeles de filtro y esponjas delgadas en una cuba para que el tampón de transferenciaatraviese el gel y deposite las bandas proteicas sobre la membrana, que se encontrará en contacto directo con dicho gel) o bien por la aplicación de un campo eléctrico.
Para la última alternativa dispondremos de un “sándwich” conformado por una esponja delgada, papeles de filtro, el gel migrado, la membrana de nitrocelulosa, papeles de filtro y otra esponja delgada. Se aplicará el campo...
Fundamento teórico
Entre las diversas metodologías que nos permiten tener un acercamiento a la Biología celular, la metodología denominada Western Blot es una de las que nos brinda una gran cantidad de información, adaptándose a laboratorios de investigación, así como a laboratorios de diagnóstico médico.
Las proteínas pueden serconvenientemente separadas, en función de sus pesos moleculares, gracias a diversas técnicas electroforéticas. Sin embargo a veces es necesario constatar la presencia de una proteína en especial. Para cumplir éste objetivo conjugamos el poder resolutivo de la electroforesis de poliacrilamida, con la especificidad de un anticuerpo en el reconocimiento de un antígeno proteico.
En líneas generales laaproximación del Western blot nos permite el reconocimiento de una fracción proteica, cuya presencia puede servir para estudiar (por ejemplo) la expresión proteica en un sistema biológico (por ejemplo cultivo celular) o bien está relacionada a antígenos bacterianos o virales. Así la metodología del Western blot es la técnica confirmatoria para el diagnóstico de la infección por el virus HIV.
Lasproteínas presentes en un dado extracto son separadas mediante SDS-PAGE. Luego de ello las bandas proteicas del gel son transferidas a una membrana de nitrocelulosa (por capilaridad o bien aplicando un campo eléctrico) y finalmente ésta membrana es puesta en contacto con un anticuerpo específico. Dicho anticuerpo reconocerá epitopes presentes en la proteína de interés, y posteriormente será reconocido porotro anticuerpo (anticuerpo secundario, capaz de reconocer la porción Fc de las inmunoglobulinas) marcado con alguna molécula que permita luego la detección (por ejemplo biotina-estreptavidina o sistemas quimioluminiscentes) del conjunto.
Desarrollando la metodología del Western Blot
Para llevar adelante éste procedimiento de gran utilidad en el reconocimiento específico de fracciones proteicasde interés requeriremos conocer los elementos con que trabajaremos:
1) Muestra: Extracto proteico
El paso fundamental para poder aplicar la tecnología del Western blot es contar con la muestra. Ésta muestra estará constituida por el extracto obtenido del sistema bajo estudio mediante lisis celular.
2) Cuantificación del extracto
Una vez obtenida la muestra, ésta debe ser cuantificada. Esimportante conocer la cantidad sembrada en los geles para asegurarnos que podremos luego efectuar comparaciones.
3) SDS-PAGE
Tras la cuantificación del extracto (en caso de ser necesario) se debe realizar un SDS-PAGE, con el cuidado de sembrar en cada pocillo la misma cantidad de proteínas.
La electroforesis se detiene cuando el frente de corrida alcance la migración apropiada y se quita el gel delsistema. Posteriormente se equilibra el gel en tampón de transferencia para seguir adelante con el procedimiento.
4) Transferencia
La corrida electroforética (con todas las bandas proteicas separadas) será transferida a una membrana de nitrocelulosa. No observaremos ninguna banda o color en el gel migrado, excepto el del frente de corrida.
Equilibraremos el gel migrado así como papeles defiltro y esponjas delgadas cortadas al tamaño del gel en Tampón de Transferencia. Dicho tampón tiene como base al mismo tampón de migración de la SDS-PAGE con el agregado de metanol, que facilitará la transferencia proteica a la nitrocelulosa.
La transferencia puede llevarse a cabo por capilaridad (colocando capas de papeles de filtro y esponjas delgadas en una cuba para que el tampón de transferenciaatraviese el gel y deposite las bandas proteicas sobre la membrana, que se encontrará en contacto directo con dicho gel) o bien por la aplicación de un campo eléctrico.
Para la última alternativa dispondremos de un “sándwich” conformado por una esponja delgada, papeles de filtro, el gel migrado, la membrana de nitrocelulosa, papeles de filtro y otra esponja delgada. Se aplicará el campo...
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