Determinación de actividad peroxidasa soluble en extractos de rábano, de nabo, saliva y leche desnatada pasteurizada.
Páginas: 5 (1158 palabras)
Publicado: 21 de febrero de 2011
DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD DE PEROXIDASA Y DE SU REGENERACIÓN.
La peroxidasa es una enzima que cataliza la oxidación de ciertos compuestos dadores de hidrógeno, como fenoles (guayacol, pirogalol) y aminas aromáticas (o-fenilendiamina) por medio de peróxidos ([pic]). El substrato oxidable más usado es el guayacol, que es oxidado a un complejo coloreado de tetraguayacol en presencia deperoxidasa:
[pic]
La velocidad de formación del color rojo ladrillo puede ser utilizada como medida de la actividad enzimática por lecturas espectrofotométricas de las absorbancias en relación con el tiempo.
La peroxidasa presenta como grupo prostético un grupo Hem, cuyo átomo central de hierro forma complejos con diferentes compuestos, como los cianuros y la hidroxilamina, inhibiéndose suactividad enzimática.
La actividad enzimática depende del vegetal (los rábanos picantes son especialmente activos), del substrato oxidable que se emplea como reactivo y del pH y temperatura a que se trabaja.
Como la mayoría de las enzimas, la peroxidasa puede ser inactivada por el calor, siendo una de las que precisa mayor temperatura y más tiempo para su inactivación. Posee, además, lapropiedad peculiar de la regeneración enzimática. Este fenómeno consiste en que al inactivarla por medio del calor recupera parcialmente su actividad después de un cierto tiempo. Esto ha sido explicado, aduciendo que la fracción proteica de la enzima sufre una desnaturalización sólo parcial, con pérdida de su estructura terciaria, si el calor se aplica un tiempo muy corto, produciéndose luego unareversión de la proteína a su estado normal por recombinación de sus grupos hidrógenos o sulfhidrílicos.
Este efecto del calor sobre la actividad peroxidásica es muy, importante en la industria de alimentos y la regeneración enzimática de la peroxidasa puede causar serios problemas en los caracteres organolépticos. Se ha demostrado en el laboratorio que esta actividad enzimática puede detenersetotalmente, si el calentamiento es suficientemente largo, de manera que sobre 30" la regeneración es muy débil generalmente.
La investigación de la peroxidasa ha sido usada para evaluar la eficiencia del escaldado o blanqueo de verduras y también en el control de pasteurización de la leche. Así, a la temperatura de pasteurización, la lactoperoxidasa se inactiva, pero se regenera; en cambio, si laleche es sobrecalentada (más de 80-85 °C) la peroxidasa pierde su actividad en forma definitiva.
b) Procedimiento: Colocar 0,1 ml de guayacol liquido junto con 0,2 ml de [pic]al 0,9% y 4,7 ml de agua en un tubo de ensayo (a). Dentro de un tubo del espectrofotómetro colocar 1 ml de jugo de expresión de nabo, filtrado y diluido (1 + 199) y 4 ml de agua (b). Agregar la mezcla de guayacol y aguaoxigenada (a) al tubo del espectrofotómetro y tomar el tiempo con cronómetro. Vaciar rápidamente la mezcla al tubo vacío y luego nuevamente al tubo del espectrofotómetro. Colocar el tubo en el espectrofotómetro, previamente estandarizado con agua a 470 nm. Anotar las lecturas de absorbancia a 470 nm cada 20 segundos hasta obtener 4 ó 5 puntos. Graficar las lecturas de absorbancia contra los tiempospara obtener así la graduación de la reacción.
c) Regeneración: Colocar alrededor de 4 ml del jugo diluido (1 + 199) en tres diferentes tubos de ensayo. Colocarlos en un baño hirviente (o calentado al vapor) y sacar el primer tubo después, de 30 segundos, el 2º después de 1 minuto y el 3º después de 2 minutos. Enfriarlos rápidamente en un baño de agua y determinar de inmediato la actividadperoxidásica, como Se ha descrito anteriormente. Después de 1 hora repetir la determinación de la actividad en los tres tubos calentados.
DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD PEROXIDASA SOLUBLE EN EXTRACTOS DE RÁBANO, DE NABO, SALIVA Y LECHE DESNATADA PASTEURIZADA.
Procedimiento.
1. Picar en trozos más de 2 gramos de pulpa de nabo, pesar 2'00 g y transferir a una bolsa de plástico adecuada.
2....
La peroxidasa es una enzima que cataliza la oxidación de ciertos compuestos dadores de hidrógeno, como fenoles (guayacol, pirogalol) y aminas aromáticas (o-fenilendiamina) por medio de peróxidos ([pic]). El substrato oxidable más usado es el guayacol, que es oxidado a un complejo coloreado de tetraguayacol en presencia deperoxidasa:
[pic]
La velocidad de formación del color rojo ladrillo puede ser utilizada como medida de la actividad enzimática por lecturas espectrofotométricas de las absorbancias en relación con el tiempo.
La peroxidasa presenta como grupo prostético un grupo Hem, cuyo átomo central de hierro forma complejos con diferentes compuestos, como los cianuros y la hidroxilamina, inhibiéndose suactividad enzimática.
La actividad enzimática depende del vegetal (los rábanos picantes son especialmente activos), del substrato oxidable que se emplea como reactivo y del pH y temperatura a que se trabaja.
Como la mayoría de las enzimas, la peroxidasa puede ser inactivada por el calor, siendo una de las que precisa mayor temperatura y más tiempo para su inactivación. Posee, además, lapropiedad peculiar de la regeneración enzimática. Este fenómeno consiste en que al inactivarla por medio del calor recupera parcialmente su actividad después de un cierto tiempo. Esto ha sido explicado, aduciendo que la fracción proteica de la enzima sufre una desnaturalización sólo parcial, con pérdida de su estructura terciaria, si el calor se aplica un tiempo muy corto, produciéndose luego unareversión de la proteína a su estado normal por recombinación de sus grupos hidrógenos o sulfhidrílicos.
Este efecto del calor sobre la actividad peroxidásica es muy, importante en la industria de alimentos y la regeneración enzimática de la peroxidasa puede causar serios problemas en los caracteres organolépticos. Se ha demostrado en el laboratorio que esta actividad enzimática puede detenersetotalmente, si el calentamiento es suficientemente largo, de manera que sobre 30" la regeneración es muy débil generalmente.
La investigación de la peroxidasa ha sido usada para evaluar la eficiencia del escaldado o blanqueo de verduras y también en el control de pasteurización de la leche. Así, a la temperatura de pasteurización, la lactoperoxidasa se inactiva, pero se regenera; en cambio, si laleche es sobrecalentada (más de 80-85 °C) la peroxidasa pierde su actividad en forma definitiva.
b) Procedimiento: Colocar 0,1 ml de guayacol liquido junto con 0,2 ml de [pic]al 0,9% y 4,7 ml de agua en un tubo de ensayo (a). Dentro de un tubo del espectrofotómetro colocar 1 ml de jugo de expresión de nabo, filtrado y diluido (1 + 199) y 4 ml de agua (b). Agregar la mezcla de guayacol y aguaoxigenada (a) al tubo del espectrofotómetro y tomar el tiempo con cronómetro. Vaciar rápidamente la mezcla al tubo vacío y luego nuevamente al tubo del espectrofotómetro. Colocar el tubo en el espectrofotómetro, previamente estandarizado con agua a 470 nm. Anotar las lecturas de absorbancia a 470 nm cada 20 segundos hasta obtener 4 ó 5 puntos. Graficar las lecturas de absorbancia contra los tiempospara obtener así la graduación de la reacción.
c) Regeneración: Colocar alrededor de 4 ml del jugo diluido (1 + 199) en tres diferentes tubos de ensayo. Colocarlos en un baño hirviente (o calentado al vapor) y sacar el primer tubo después, de 30 segundos, el 2º después de 1 minuto y el 3º después de 2 minutos. Enfriarlos rápidamente en un baño de agua y determinar de inmediato la actividadperoxidásica, como Se ha descrito anteriormente. Después de 1 hora repetir la determinación de la actividad en los tres tubos calentados.
DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD PEROXIDASA SOLUBLE EN EXTRACTOS DE RÁBANO, DE NABO, SALIVA Y LECHE DESNATADA PASTEURIZADA.
Procedimiento.
1. Picar en trozos más de 2 gramos de pulpa de nabo, pesar 2'00 g y transferir a una bolsa de plástico adecuada.
2....
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