Determinación De Aminoacidos Por Hplc

DETERMINACIÓN DE AMINOACIDOS POR HPLC.
Condiciones de trabajo:
* Fase móvil A: Buffer de fosfato de sodio (10 mM, pH=7.3): Metanol: Tetrahidrofurano. (80: 19: 1).
* Fase móvil B: Buffer defosfato de sodio ( mM, pH=7.3): Metanol (20:80).
* Flujo: 0.1 mL/min hasta los 3 min y después 1.0 mL/min.
* Volumen de la inyección: 200 µL (100µL de muestra y 100µL de reactivo de OPA).
*Detector defluorescencia
Exitación: 340 nm
Emisión: 426 nm
* Columna:Kromasil 100ª C18 5µm, 250 X 4.6 mm

* Preparación de estándares de aminoácidos con una concentración 0.1 mM y aorar en10 mL de fase Metanol: Agua (50:50).
* Reacción de derivatización del estándar de AA. Tomar 100 µL del reactivo OPA y colocarlos en un ependorf, agitar en un vortex 5 minutos. Inyectar los 200µL.
* Preparación de la muestra. Pesar de 2-5mg de la muestra en viales pequeños, no tocar con la mano y si es así limpiar el vial. Colocarlos en el vial para llevar a cabo la hidrólisis. Adicionar200 µL de la solución HCl/Fenol. (6 N HCl con 1% de fenol). Colocar el vial en el equipo Pico-TAG para generar una atmosfera inerte.
1. Prender la bomba
2. Abrir la llave del gas N 10 psi depresión
3. Colocar el vial, poner el botón verde del vial hacia dentro para favorecer la entrada de N.
4. Abrir la llave del vacío
5. Contar 30 segundos y contar.
6. Abrir la llave deNitrogeno
7. Contar 5 segundos y cerrar.
8. Repetir 3 veces

* Luego colocar el botón rojo hacia dentro para cerrar el vial. Colocar el vial en la entrada donde se genera el calor.
* Latemperatura tiene que estar a 150 °C y la muestra se deja 1 h. Se saca y se enfria en la campana, se libera el vacío.

* Preparación de la muestra para la reacción de derivatización:
-Una vezque se tiene la muestra hidrolizada, agregar 150 µL de la fase Metanol: Agua (50:50) y agitar con un vortex.
-Filtrar.
-Tomar 100µL del filtrado y adicionar 100µL del reactivo OPA.
-Agitar en...