Determinación de azucares

Experimento. Determinación de la constante de Michaelis para la hidrólisis de sacarosa por la levadura β-fructofuranosidasa. (β-D-fructofuranosida fructohidrolasa).
Principios.
Β-Fructofuranosidasaes una glucosidasa que se encuentra en las levaduras y cataliza la hidrólisis de sacarosa a glucosa y fructosa. La enzima es también conocida como sacarosa invertasa, pero este nombre trivial ya nose usa.
El sustrato sacarosa es un azúcar no reductor, mientras que ambos productos son reductores. La reacción por lo tanto puede ser seguida midiendo la cantidad de azúcares reductores formados.Muchos métodos pueden ser usados para estimar el total de azúcares reductores o de glucosa formados pero el método conveniente para la clase utiliza el activo de Benedict.

Materiales.
1.- Activo deBenedict.
2.- Levadura para hornear fresca.
3.- Preparación de β-Fructofuranosidasa (Suspensión de levadura en solución amortiguadora al 1%)
4.- Amortiguador Citrto-fosfato (0.2M, pH 4.5) (0.2% deantrona en H2SO4)
5.- Hidróxido de Sodio al 1%
6.- Sacarosa (3M)
7.- Solución estándar de glucosa 5 mg/ml
Método.
Preparar una sere de tubos que contengan la siguiente mezcla:
Tubo Sacarosa (ml)Agua (ml) Amortiguador (ml) Enzima (ml)
1 10 0 6 4
2 8 2 6 4
3 6 4 6 4
4 4 6 6 4
5 2 8 6 4
B 10 0 10 0

Poner los tubos en un baño de agua a 37°C y permitir al contenido que se equilibre.Empieza la reacción por la adición de 4ml de suspensión de levadura a cada tubo. Es sugerible que la levadura sea adicionada a los tubos en intervalos de 1 min, por ejemplo; tubo 1 al tiempo 0, tubo 2 almin1, tubo 3 al min 2, etc. Esto le permitirá a la incubación tener tiempo para ser medida exactamente y asegurar que cada tubo es incubado por el mismo periodo de tiempo. Incubar cada tubo por 6 minexactamente y entonces parar la reacción adicionando 2 ml de hidróxido de sodio al 1%. Esto será al minuto 6 para el tubo 1, al minuto 7 para el tubo 2 y así consecutivamente.
Estimar la cantidad...