DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA UREASA EN UN EXTRACTO ENZIMÁTICO

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA UREASA EN UN EXTRACTO ENZIMÁTICO
Integrantes:
PALABRAS CLAVE: Ureasa, , actividad enzimática, velocidad de reacción, inhibidores.
OBJETIVO GENERAL: Analizar el comportamiento del extracto vegetal como enzima midiendo el contenido de proteína, su actividad enzimática y su efecto sobre la velocidad de reacción en la descomposición de la urea.OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Identificar y realizar procedimientos para la determinación de la concentración de proteínas en extractos vegetales.
Medir la concentración del producto en una reacción catalizada por una enzima en función de la concentración de esta.

DATOS COLECTADOS:
Determinación del contenido de proteína en el extracto crudo.
concentración patrón caseina 5mg/ml

tubo
b
1
2
3
4
5
6
7
8
absor0
0,028
0,072
0,120
0,228
0,420
0,218
0,353
0,650
conce
0
0,1
0,3
0,5
1
1,5




Determinación de la actividad enzimática
C oncentración HCl 0,075M

tubo
b
1
2
3
4
5
vHCl
9,2
9,9
10,3
11,7
14,5
x

concentraciones de los tubos de ensayo:
C1= CONCENTRACIÓN DE LA CASEÍNA = 5,0 mg/ml
V1= VOLUMEN AGREGADO DE LA CASEINA CORRESPONDIENTE SEGÚN LA TABLA
V2= VOLUMEN TOTAL DEL TUBO DE ENSAYO.
C2=CONCENTRACIÓN TOTAL DEL TUBO DE ENSAYO
C1*V1=C2*V2
C2= C1*V1 / V2

tubo 1
C2= 5.0 mg/ml * 0.1ml /5.0 ml =0.1 mg/ml
tubo 2
C2= 5.0 mg/ml * 0.3ml /5.0 ml =0.3mg/ml
tubo 3
C2= 5.0 mg/ml * 0.5 ml /5.0 ml =0.5 mg/ml
tubo 4
C2= 5.0 mg/ml * 1 ml /5.0 ml =1 mg/ml
tubo 5
C2= 5.0 mg/ml * 1.5 ml /5.0 ml =1.5 mg/ml


y = 0,269x - 0,007

-----CÁLCULOS INTERPOLACIÓN:
concentración tubo 6
X=0,218+0,007/0,269= 0,84 mg/mlc1v1=c2v2
c1(0,25)=0,84(5)
c1=0,84(5)/0,25 = 16,8 mg/ml
concentración tubo 7
X=0,353+0,007/0,269= 1,34 mg/ml
c1v1=c2v2
c1(0,25)=1,43(5)
c1=1,34(5)/0,25 = 14,3 mg/ml

Ct=(ctubo6+ctubo7)/2 =(16,8+14,3)/2 =15,55mg/ml

Como se prepararon 50 mL del extracto vegetal, se tiene un total de

15,55 mg/mL * 50 mL = 775mg * (1 g / 1000 mg) = 0,775 g

Como el extracto se preparó con 2,5g de harina,entonces

(0,775g / 2,5 g) *100 = 31.1 % (concentración de proteína en harina de fríjol de soya)

volumen HCl
tubo 1: 9,9-9,2 =0,7
tubo 2: 10,3-9,2 =1,1
tubo 3: 11,7-9,2 =2,5
tubo 4: 14,5-9,2=5,3


vHClxcHCl=nHCl
tubo1 =0,7x0,075=0,0525
tubo2 =1,1x0,075=0,0825
tubo3 =2,5x0,075=0,1872
tubo4 =5,3x0,075=0,3975

cNH3=nNH3/vtotal de cada tubo

POR LA REACCIÓN DE TITULACIÓN QUE ES:
NH3 + HCL ------NH4CL
tubo1
0,0525/13 = 0,00403846
tubo2
0,0825/13 = 0,00634615

tubo3
0,1872/13 = 0,01442308
tubo4
0,3975/13 = 0,03057692
Cálculos para la velocidad de reacción

v0=cNH3/tiempo de reacción
tubo1
0,00403846/30min =1,34E-4 mmol/ml/min
tubo2
0,00634615/30 =2,11E-4 mmol/ml/min
tubo3
0,01442308/30 = 4,80E-4 mmol/ml/min
tubo4
0,03057692/30 =1,02E-3 mmol/ml/min



actividad específica
tubo 1
1,34E-4mmol/ml/min=1,03Umol/ml/min=1,03UI
15,55x0,5=7,775
1,03/16,5=0,17 UI/mg

tubo2
2,11E-4mmol/ml/min=2,11umol/ml/min=2,11UI
15,55x1=15,55
2,11/15,55=0,13 UI/mg

Actividad específica promedio = (0,17 + 0.13)/2 = 0.15UI/mg



DISCUSIÓN Y ANÁLISIS DE RESULTADOS:

Utilizando método colorimétrico biuret se cálculo de la concentración de la proteína presente en la harina de fríjol de soya, haciendo laconstrucción de una curva de calibración, se interpolaron los datos y el valor determinado fue 31,1% P/P para el material empleado. De acuerdo con la literatura, se encontró que el grano de soya está compuesto principalmente por lípidos, carbohidratos, minerales y proteínas, donde estas últimas se presentan en concentraciones de entre 37 % y 38 % (Corpoica, 2006). Lo que indica que la muestra se encontraba enuna cantidad inferior de proteínas, esto se debe a que los tratamientos implementados para eliminar lo que se conoce como factores antinutricionales, se realiza por desnaturalización de proteínas, lo que conlleva a la pérdida de una cantidad de las mismas presentes en el grano (Ramos et al, 2006).

El comportamiento entre entre la cantidad de producto que cataliza diferentes volúmenes del...