Determinación de la actividad enzim á tica de peroxidasas (catalasa

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Determinación de la actividad enzim
á
tica
de peroxidasas (catalasa)
Cedillo Jiménez, C.
A.
Facultad de Ciencias Químicas
Universidad Autónoma de Querétaro
Hernández López, J.
L.
Centro de Investigación y Desarroll
o
Tecnológico en Electroquímica
R
ESUMEN
Se determino la actividad enzimática de la catalasa en una muestra de sangre fresca,
variando condiciones de pH (tresniveles:
4
.
96
,
6
.
94
y
9
.
04
) y de concentración de
sustrato (siete niveles:
0
.
0042
,
0
.
0083
,
0
.
0166
,
0
.
0332
,
0
.
0415
,
0
.
0498
y
0
.
0664
M), titulando
con permanganato de potasio el peróxido de hidrogeno remanente. Se encontró
diferencia significativa entre ambas variables (pH y concentración de sustrato). Se
encontró que a mayorconcentración de sustrato (en el intervalo de concentracione
s
manejadas), el efecto en la velocidad era positivo; entre pH
6
.
94
y
9
.
04
se encontró
mayor efecto en la velocidad, el pH
4
.
96
se mantuvo debajo de ambos niveles. Se trato
la enzima como si ésta se ajustara a un perfil de Michaelis
–
Menten y se estimaron l
os
parámetros cinéticos usando ajustes lineales ponderad
ospor el arreglo de
Lineweaver
–
Burk y Hanes. Se encontró que la catalasa no se ajusta a un perfil
Michaelis
–
Menten, por ello es necesario estimar los parámetros con el patrón
adecuado.
I
NTRODUCCIÓN
Las enzimas son proteínas con capacidad de catalizar reacciones biológicas. Igual que
los catalizadores inorgánicos, aumentan la velocidad para alcanzar el equilibrio de la
reacción. Elmecanismo por el cual las enzimas incrementan la velocidad de la
2
reac
ción es reduciendo la energía libre de activación requerida para la transformar
un sustrato al producto correspondiente, sin afectar la constante de equilibrio.
La
actividad de una enzima se evalúa en función de la velocidad de la reacción. La
cinética enzimática estudia la velocidad de la reacción, los factores que lamodifican y
el mecanismo de la misma. Los factores fisicoquímicos que modifican la actividad de
la
enzima son: concentración del sustrato, concentración de la enzima, pH,
temperatura, fuerza iónica, inhibidores.
Leonor Michaelis y Maud Menten en
1913
, propusieron un modelo clásico para el
estudio de la cinética enzimática. Este modelo consiste en grafic
ar la velocidad de la
actividadenzimática y la concentración del sustrato. Esta representación gráfica
permite determinar la constante de Michaelis
–
Menten (K
M
) al interpolar la mitad de
la velocidad máxima (V
máx
).
En esta práctica se emplear
á la enzima
catalasa
para
analizar algunos aspectos de la cinética enzimática.
La catalasa u
tiliza una molécula
de peróxido de hidrógeno (H
2
O
2
) como sustratodonador de electrones y otra
molécula de H
2
O
2
como oxidante o aceptor de electrones.
La catalasa está contenida en los peroxisomas de eritrocitos, médula ósea, mucosas,
riñón e hígado. Su función es la descomposición del H
2
O
2
formado por acción de las
oxidasas.
El objetivo general es a
nalizar algunos
factores que inciden sobre la
actividad enzimática de la catalasa.
Donde:
Ay B
= Sustratos
C y D
= Productos
v
1
= Velocidad de reacción para formar productos
v
2
= Velocidad de reacción para formar reactivos
𝐴
+
𝐵
⇌
𝐶
+
𝐷
v
1
v
2
CATALASA
2
H
2
O
2
2
H
2
O
+ O
2
3
P
arte experimental
Determinación de la actividad enzimática de la catalasa: Se empleo un método
indirecto, siguiendo el procedimiento descrito por
Garzon
(
2002
)
.Se realizo el
experimento por triplicado, con un sistema aleatorizado para evitar sacar
conclusiones erróneas en la perdida de actividad enzimática por el tiempo entre la
preparación de la solución y la prueba enzimática; el orden de
las cor
ridas
se
describe en el tabla
1
.
T
ABLA
1
ORDEN DE PRUEBAS ENZ
IMÁTICAS
,
SEGÚN EL DÍA DE
EXP
ERIMENTACIÓN Y EL P
H
DE TRABAJO...