Determinación de proteínas

Unidad 3
Determinación de Proteína,
Fibra y Acidez
Noviembre 2013


Determinaciones generales
proteínas

Método Kjeldahl

• Objetivo: Determinar la concentración de
nitrógeno presente en la muestra para luego
ser transformado a través de un factor en
proteína.

Fundamento
 El método se basa en la destrucción de la materia
orgánica con ácido sulfúrico concentrado,
formándosesulfato de amonio que en exceso de
hidróxido de sodio libera amoníaco, el que se destila
recibiéndolo en:
a)
b)

Acido sulfúrico donde se forma sulfato de amonio
y el exceso de ácido es valorado con hidróxido de
sodio en presencia de rojo de metilo
Acido bórico formándose borato de amonio el que
se valora con ácido clorhídrico.

• El método de Kjeldahl consta de las siguientesetapas:
digestión – destilación – titulación

• Digestión H2SO4 con la adición de permanganato de potasio
para completar la oxidación y conversión del nitrógeno a
sulfato de amonio.

• Neutralización de la digestión diluida, seguida de una
destilación en un volumen conocido de ácido estándar con un
contenido de ioduro de potasio e yodato.

• Titulación del yodo liberado con tiosulfato desodio estándar.

• El método Kjeldahl no determina, sin
embargo, todas las formas de N a menos que
se modifiquen adecuadamente; esto incluye
nitratos y nitritos.
• Para convertir el N a proteína se emplea el
factor de 6.25 el cual proviene de la
consideración de que la mayoría de las
proteínas tienen una cantidad aproximada de
16% de nitrógeno.

Factores de conversión de N a
proteínaCalculo de proteínas

 V : 50 mL H2SO4 0.1N - gasto NaOH 0.1N o gasto de HCl 0.1 N (volumen del
acido corregido)
 m : masa de la muestra, en gramos
 Factor calculado para la muestra
 14: peso atomico del nitrogeno
 N: normalidad del acido clorhidrico

Datos
• Repetibilidad del método: La diferencia entre los
resultados de dos determinaciones efectuadas una
después de otra, porel mismo analista, no debe
exceder 0.06 % de Nitrógeno o 0.38 % de proteína.
• Se debe indicar el método utilizado, identificación
de la muestra, peso de muestra, gastos de
titulación, factor utilizado y resultados obtenidos
de la muestras en duplicado con 2 decimales.

Método Biuret
• En solución alcalina el Cu+2 reacciona con el
enlace peptídico de las proteínas dando un
colorpurpúreo que se cuantifica
espectrofotométricamente (540nm).
• Como estándar se utiliza una solución de
albúmina.
• Mide concentraciones entre 0,5- 100% mg

 5 ml de reactivo de Biuret se mezcla con 1ml de solución proteica
(1-10 mg de proteína/ml).
 El reactivo incluye sulfato de cobre, NaOH, y Tartrato de sodio y
potasio el cual se utiliza para estabilizar el ión cobre en la soluciónalcalina.
 Después de reposo a temperatura ambiente durante 15 a 30
minutos, se lee la absorbancia a 540nm contra un blanco con sólo
reactivo.

 Si la reacción no es clara debe centrifugarse la muestra previo a la
lectura de la absorbancia

• Se debe elaborar una curva estándar de
concentración vs absorbancia
utilizando
albúmina de suero de bovino (BSA) para
comparación con la muestrabajo estudio.

Ventajas del método de
Biuret
•
•
•
•
•

Menos caro que el método de Kjeldahl
Rápido (se puede completar en menos de 30 minutos)
Es el método más simple de análisis de proteínas
No es frecuente encontrar derivaciones de color
Pocas substancias no proteicas interfieren con la reacción
de Biuret
• No detecta N2 de fuentes no proteicas o no peptídica

Método de Lowry Fundamento:
 Combina la reacción de Biuret con la
reducción del reactivo de fenol folinciocalteau
(ácido
fosfomolíbdicofosfotúngstico) por los residuos de tirosina y
triptofano de las proteínas.
 El color azuloso desarrollado es leído a
750nm (alta sensibilidad para una
concentración proteica baja) o a 500nm (alta
sensibilidad para una concentración proteica
alta)

Ventajas...