Determinación del peso molecular de una proteina por cromatografia de exclusion


INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA
MÉTODOS DE ANÁLISIS

PRÁCTICA: DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR DE UNA PROTEÍNA POR CROMATOGRAFIA DE EXCLUSIÓN
GRUPO: 5QV1
SECCION: 2
ALUMNO: VAZQUEZ RAMIREZ ALFONSO







INTRODUCCIÓN
La cromatografía es una técnica que permite la separación de moléculas diferentespresentes en una misa muestra. El método está basado en la circulación de una fase móvil que arrastra la muestra a través de una fase estacionaria.
La cromatografía por exclusión molecular (a menudo también llamada “tamiz molecular” o “filtración en gel”) es una de las técnicas más sencillas de las empleadas en la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Este tipo de cromatografía se realiza encolumnas cilíndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican con este fin y que pueden ser de varios tipos: Dextranos con enlaces cruzados (Sephadex), Agarosa, Poliacrilamida, etc. Estos geles (fase estacionaria) se hallan constituidos por gránulos (partículas) de un material esponjoso, que contiene poros con un tamaño de diámetro determinado.
Cuando se hace pasar una mezcla de moléculasde distinto tamaño, a través de una columna de filtración en gel; aquellas moléculas con un tamaño mayor que el diámetro de los poros de las partículas, solo podrán moverse en su camino, a través de la fase estacionaria, en el espacio que queda entre las partículas; y por lo tanto, no se verán retrasadas en su descenso. En cambio aquellas moléculas capaces de penetrar en las partículas se veránretrasadas por la fase estacionaria; en mayor medida, cuanto menor sea su tamaño. Por lo tanto, las moléculas eluyen en este tipo de cromatografía por orden decreciente de tamaño molecular.
Se denomina Vt (Vol. total) al volumen que ocupa la columna. Este puede escribirse como Vt= Vo + Vg + Vi. Estas tres contribuciones son Vol. vacío, Vol. gel y Vol. interno respectivamente. Estos volúmenes sonparámetros de la columna de gel y por lo tanto deben ser conocidos para una correcta utilización de la técnica.

OBJETIVOS
Determinar el PM de una proteína utilizando estándares de proteínas con PM conocido. Haciendo uso de métodos gráficos.
Determinar el Vo del lecho cromatografico usando una sustancia de PM que sobrepase el límite de exclusión del gel usado.
Utilizar un gel apropiado paraeluir proteínas de peso molecular conocido y en base a su perfil de elución determinar su Ve.
Comprender el fundamento de la cromatografía por exclusión molecular.
Revisar las consideraciones pertinentes en el desarrollo de esta técnica.















RESULTADOS
Determinación de Vo
Vol. Elución
A615nm
3
0
6
0.01
9
0.013
12
0.146
15
1.496
18
0.386
21
0.049
240.025
27
0.013
30
0.015
Tabla 1. Lecturas de Absorbancia, para calcular el Vol. Vacío del lecho cromatografico usando Dextrana Azul.

Figura 1. Relación grafica de los volúmenes de elución de fracciones colectadas y sus lecturas a 615 nm, en donde se muestra un máximo de Abs en la fracción 5(15 mL).



Volumen
Lisozima
Hemoglobina
Tripsina
Pepsina
Prot. Problema
3
0
0
0
0
0
60
0
0
0.201
0.087
9
0
0
0
0.179
0.091
12
0
0.431
0
0.174
0.093
15
0
2.511
0
0.792
0.099
18
0
2.208
0.105
1.542
0.167
21
0.014
1.592
0.39
2.501
0.242
24
0.211
0.917
0.639
1.505
0.199
27
1.192
0.477
0.463
1.499
0.147
30
2.067
0.236
0.477
1.411
0.138
33
1.701
0.117
0.607
1.134
0.128
36
0.753
0.062
0.487
1.303
0.117
39
1.291
0.040.442
1.147
0.091
42
0.278
0.032
0.329
1.039
0.09
45
0.103
0.025
0.219
0.864
 
48
0.056
0.024
0.091
0.801
 
51
0.075
0.021
0.072
0.528
 
54
0.045
0.016
0.069
0.399
 
57
0.032
 
0.066
0.274
 
60
0.036
 
0.023
0.243
 
63
0.041
 
0.025
0.211
 
66
0.033
 
0.022
0.191
 
69
 
 
0.017
0.186
 
72
 
 
0.014
0.175
 
75
 
 
0.008
0.173...