Determinación Experimental De Parámetros Cinéticos

Cinética Enzimática:




Determinación de Parámetros cinéticos




De Tirosinasa.


























Introducción


En este práctico se estudiará la cinética enzimática de la Tirosinasa, el cual tiene como objetivo estudiar las velocidades de reacción catalizadas por enzimas con las que es posible entender más a fondo el mecanismo a travésdel cual trabaja la enzima en el organismo, su rol metabólico y la dependencia de la concentración Enzima-Sustrato a las velocidades de reacción.
Para medir la velocidad de reacción catalizada por la enzima Tirosinasa y obtener constantes cinéticas como velocidad inicial (V0), Km y velocidad máxima (Vmáx), se puede utilizar una propiedad intrínseca de las moléculas, la absorción de radiaciónelectromagnética, la cual se encuentra relacionada con la concentración mediante la ley de Lambert-Beer. Así se logra estudiar la velocidad de desaparición del sustrato o aparación del producto, todo en función del tiempo.
La medición de las velocidades debe ser realizada en condiciones óptimas de la enzima teniendo en cuenta cofactores, pH, coenzimas y temperatura.
El modelo de Michaelis ymenten se utiliza para explicar la mayor parte de las reacciones enzimáticas donde la enzima reacciona reversiblemente con el sustrato, complejo ES, que luego se rompe para liberar el producto. Para que todo esto ocurra la concentración del sustrato debe ser mayor que la concentración de la enzima y, también, que la concentración del complejo Enzima-Sustrato sea constante.
En estaexperiencia se estudia la cinética de la enzima Tirosinasa la cual cataliza la reacción de oxidación de fenoles, como la Tirosina, utilizando O2 como sustrato. Dicha enzima cataliza la producción de Melamina y otros pigmentos de la oxidación de la Tirosina.
El práctico se divide en dos partes, en la parte A se obtienen las absorbancias a través del tiempo manteniendo constante el volumen de sustrato(Dopa en este caso), y variando el volumen de Tirosinasa obteniendo así el mejor volumen de enzima para utilizar en los estudios cinéticos posteriores. En la parte B de mide la absorbancia a través del tiempo, ésta vez variando el volumen de sustrato (Dopa) y manteniendo constante la concentración de enzima a estudiar, obteniendo los parámetros cinéticos correspondientes a Km y Vmáx.Objetivos


- Determinar las velocidades iniciales de las reacciones por medio de la pendiente de gráficos de absorbancia versus tiempo.
- Identificar la mejor recta de acuerdo al valor de r.
- Seleccionar la concentración adecuada de Tirosinasa a utilizar en los estudios cinéticos según la recta elegida.
- Graficar velocidad versus concentración de sustrato y deducir si laenzima sigue una cinética Micheliana.
- Determinar parámetros cinéticos (km y Vmáx) de la Tirosinasa mediante gráficos de Michaelis-Menten.
- Determinar Km y Vmáx mediante un gráfico lineal Hannes y Woolf o L-Burk.



Materiales y métodos empleados

- Micropipeta 10-100 µL
- Micropipeta 100-1000 µL
- Cubetas
- Espectrofotómetro
- Cronómetro
- Vasoprecipitado
- Papel Film.

Reactivos:

- Tampón Fosfato 0.1 M a pH=7
- Tirosinasa 1mg/mL
- Dopa 5 mM

Parte A

Se agrega a cada celda los reactivos en el siguiente orden: Tampón-Dopa-Enzima. Luego se mide la Absorbancia de cada celda a 475 nm, durante 2 minutos realizando lectura cada 15 segundos desde el momento de homogenizar la solución en cada celda.
Posteriormente segrafica Absorbancia versus Tiempo para cada celda y se determina la pendiente para cada grafico y la mejor recta, la cual corresponde a la cantidad de enzima adecuada para los estudios cinéticos de ésta.

Parte B

Se prepararon celdas agregando los reactivos en el siguiente orden: Tampón-Dopa –Enzima. Se registra la absorbancia a 475 nm a cada tubo en las mismas condiciones que en la parte A,...