determinación viabilidad celular
Páginas: 2 (467 palabras)
Publicado: 9 de diciembre de 2014
3.7. Determinación de viabilidad celular.
La viabilidad celular se determinó rutinariamente por dos técnicas complementarias.
3.7.1. Exclusión con azul tripán.
La viabilidad celular de lasmuestras biológicas se estudió mediante la técnica de exclusión con azul tripán (para 100 mL: NaCl, 0.81 g; KH2PO4, 0.66 g y azul tripán, 0.4 g, pH 7.2, Sigma-Aldrich Co, Saint Luis, MO, EEUU). Paraello se mezcló en una proporción 1:1 (v:v) la suspensión celular y el azul tripán. El recuento celular se llevó a cabo mediante el uso de un hemocitómetro Neubauer, según la ecuación:
C es laconcentración expresada en células por mililitro. A es la medida del número de células determinadas en las cuadrículas del hemocitómetro y D el factor de dilución empleado.
Las células muertas, con lamembrana deteriorada, permiten el paso del colorante y se tiñen intensamente. El número de células vivas de la muestra se calculó contabilizando el número de células no teñidas.
3.7.2. Método deMTT.
El ensayo con MTT se emplea para valorar la viabilidad y estado de proliferación de las células. El MTT (Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol; Sigma-Aldrich Co, Saint Luis,MO, EEUU), es un compuesto que se incorpora a las células y es reducido por la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa, generando un producto metabólico denominado azul de formazán que precipitaal ser insoluble. Las células en estado proliferativo necesitan mayor cantidad de ATP para llevar a cabo la replicación de su material genético. Por tanto, cuanto más elevado sea el estado metabólicode la célula, mayor número de cristales de formazán obtendremos, asumiendo que la intensidad del color será proporcional al número de células viables y en estado proliferativo.
Para determinar laviabilidad de nuestros cultivos celulares, una vez retirado los sobrenadantes para el posterior análisis de producción de citoquinas, se adicionó 50 μL /pocillo de MTT a una concentración de 2...
La viabilidad celular se determinó rutinariamente por dos técnicas complementarias.
3.7.1. Exclusión con azul tripán.
La viabilidad celular de lasmuestras biológicas se estudió mediante la técnica de exclusión con azul tripán (para 100 mL: NaCl, 0.81 g; KH2PO4, 0.66 g y azul tripán, 0.4 g, pH 7.2, Sigma-Aldrich Co, Saint Luis, MO, EEUU). Paraello se mezcló en una proporción 1:1 (v:v) la suspensión celular y el azul tripán. El recuento celular se llevó a cabo mediante el uso de un hemocitómetro Neubauer, según la ecuación:
C es laconcentración expresada en células por mililitro. A es la medida del número de células determinadas en las cuadrículas del hemocitómetro y D el factor de dilución empleado.
Las células muertas, con lamembrana deteriorada, permiten el paso del colorante y se tiñen intensamente. El número de células vivas de la muestra se calculó contabilizando el número de células no teñidas.
3.7.2. Método deMTT.
El ensayo con MTT se emplea para valorar la viabilidad y estado de proliferación de las células. El MTT (Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol; Sigma-Aldrich Co, Saint Luis,MO, EEUU), es un compuesto que se incorpora a las células y es reducido por la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa, generando un producto metabólico denominado azul de formazán que precipitaal ser insoluble. Las células en estado proliferativo necesitan mayor cantidad de ATP para llevar a cabo la replicación de su material genético. Por tanto, cuanto más elevado sea el estado metabólicode la célula, mayor número de cristales de formazán obtendremos, asumiendo que la intensidad del color será proporcional al número de células viables y en estado proliferativo.
Para determinar laviabilidad de nuestros cultivos celulares, una vez retirado los sobrenadantes para el posterior análisis de producción de citoquinas, se adicionó 50 μL /pocillo de MTT a una concentración de 2...
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