Determinacion De Enzimas

Determinación de la actividad enzimática.
La actividad proteolítica de los microorganismos tratados térmicamente se evaluó mediante la determinación de grupos amino (-NH2 )libres por el método del 2,4,6 ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) (Barton et al., 1993; Mc Kellar, 1981). Los cultivos tratados térmicamente y un cultivo sin ningún tratamientotérmico se inocularon en leche descremada reconstituída al 2% v/v y se incubaron a 40ºC/15 horas. Muestras por duplicado de 2 ml del extracto obtenido por centrifugación decada suspensión de bacterias y de leche descremada reconstituida se trataron con 4 ml de ácido tricloroacético al 12% p/v, por 20 min a 25 ºC, seguido de filtración en papelWhatman 42. Duplicados de 0,2 ml de cada filtrado se mezclaron con 2 ml de solución buffer de borato de sodio 0,1M (pH 9,5) y 0,8 ml de TNBS 1000 mg/ml (Sigma P2297) y se incubaron enla oscuridad a 25 ºC por 30 min. También se colocaron en incubación volúmenes iguales de soluciones patrón de glicina (1 - 12 mmoles/ml) tratadas de igual manera pero nofiltradas. Al finalizar el período de incubación se adicionaron, para detener la reacción, 0,8 ml de fosfato sódico 2M conteniendo 18mM de sulfito de sodio y se leyó la absorbancia a420 nm en un espectrofotómetro (Baush & Lomb, Spectronic 20) contra un blanco de agua destilada. Las absorbancias se convirtieron a micromoles de grupos amino libres pormililitro de suspensión mediante una curva patrón. La proteólisis se expresó como la concentración de grupos amino (-NH2) libres solubles en ácido tricloroacético por mililitro desuspensión (Dmmoles/ml). Sánchez, M. Atenuación térmica de cultivos lácticos destinados a la maduración acelerada de quesos. REVISTA DE LA FACULTAD DE FARMACIA Vol. 42, 2001