DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE BRADFORD Y LOWRY

INTRODUCCIÓN:
Método de Lowry:
Es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la
muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las
proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de
proteínas, según la ley de Lambert-Beer
Este método consta de dos etapas:
1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínasformando
complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos
complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el
desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose
los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la
reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo
contartrato.
2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por
los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las
proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del
reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color
amarillo, que al ser reducido por los grupos fenolicos da lugar a un complejo
decolor azul intenso.
Método de Bradford:
Está basado en el cambio de color del colorante Coomassie brilliant blue G-250
en respuesta a diferentes concentraciones de proteínas.
Este compuesto interacciona con aminoácidos básicos (especialmente arginina)
y aromáticos. Esta unión del colorante con las proteínas provoca un cambio en
el máximo de absorción del colorante desde 465 a 595 nm. Por lotanto, este
método se basa en la propiedad del Azul Brillante de Coomasie G-250 de
presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se
convierte en azul cuando el colorante se une a la proteína.

OBJETIVOS:
•

Elaborara una curva de calibración para la cuantificación de proteínas
empleando un método fotométrico.

•

Determinara si hay diferenciaestadísticamente significativa en la
precisión y la exactitud entre los métodos de Bradford y Lowry.

•

Conocerá el efecto de sustancias no proteínicas, en el desarrollo de color

•

Analizara las ventajas y desventajas del método Lowry, con respecto a
otros métodos para la cuantificación de proteínas.

DATOS EXPERIMENTALES E INFORME:
Tabla 3. Curva de calibración de albumina. Método de Lowry.Tub
o

Cantidad de
proteína (μg)

A590
Serie A

Serie B

Serie ajustada por
regresión lineal.

1

25

0.062

0.066

0.066

2

50

0.161

0.120

0.126

3

75

0.208

0.174

0.178

4

100

0.244

0.229

0.231

5

125

0.291

0.283

0.281

Curva de calibración de albumina
140
120

f(x) = 441.78x - 10.35
R² = 0.96

Proteína (μg)100
80
60
40
20
0
0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

A590

CUESTIONARIO:
a) Calcule y escriba los valores de la pendiente, la ordenada al origen,
y el coeficiente de correlacion; diga como se interpretan para la curva
de calibración.
b = 0.00217 y refiere a la sensibilidad del método, a= 0.012 es una constante
lo cual quiere decir que este valor no depende delcambio en la concentración
de proteína, siendo un valor de referencia de la curva (blanco), el valor del
coeficiente de correlación r= 0.96926 refiere a la reproducibilidad de los datos
lo que acredita al analista.

b) ¿Cumple su curva la ley de Bouger y Beer? ¿Entre que limites de
cantidad de proteína?
El método de Lowry si obedece la ley, Los limites se encuentran entre 25 –
125microgramos; por tanto, esos limites nos indican que la proporcionalidad
en la cantidad de proteína aumenta con respecto a la absorbancia de la
muestra.
c) A partir de la ecuación de la recta ajustada por regresión lineal,
calcule el factor de calibración de la curva. ¿Cuál es la importancia de
este y para que se utiliza?
Fc= 1/m = 18.5, La importancia de este valor determina el inverso de la...