Determinacion de una muestra problema por HPLC





















Cromatografía de Liquidos
HPLC























RESUMEN

En este práctico se conocerán los fundamentos y características de un cromatógrafo de líquido de alta resolución (HPLC).
Se efectuara la determinación cualitativa y cuantitativa de una muestra problema, así como también se analizara algunos factores que afectan losparámetros analiticos en este tipo de cromatografía, como el flujo o la composición de la fase móvil.
Luego de terminado el procedimiento la identificación y cuantificación es la siguiente:

MP nº 27
Concentración (ec. Recta)
Concentración (interpol. visual)
Fenol
0,149 % v/v
0.150 %v/v
Tolueno
0,630% v/v
0.680 %v/v










INTRODUCCION

En la identificación ycuantificación mediante el método de HPLC se utiliza el principio de reparto en fase inversa donde la fase estacionaria es apolar en este caso una columna monolítica y a fase móvil es de polaridad variable para mejorar la eficiencia del método.
Este método cromatografico es útil para una mayor cantidad de analitos, ya que no requiere que sean volátiles, lo que implica que tenga una menorsensibilidad.














MATERIALES Y METODO

Materiales:

Cromatógrafo de HPLC
Bomba Merck Hitachi L-6000 Nº serial: 0720-012
Columna Chromolith Speed ROD
RP-18e 50-4.6
Nº UMO105
Detector Shimadzu UV-VIS, Modelo SPD-10AV
Integrador: ChromJet Integrator (Thermo separation products)
Solución patrón Nitrobenceno 0.004 % v/v
Solución patrónFenol 0.04 % v/v
Solución patrón Benceno 0.2 % v/v
Solución patrón Tolueno 0.2 % v/v
Solución estándar Fenol 0.05 %, Tolueno 0.2 %,
Solución muestra problema #27
Microjeringa punta roma de 100microlitros
Solventes de grado cromatográfico: agua y metanol (70:30; 80:20)
Metanol
Bueta de 25ml
4 matraces de 10ml
Embudo
Piseta con metanol
Micropipeta con puntas (muestra problema) y tuboeppendorf


Método:

1.- observar y anotar las condiciones cromatográficas (flujo, presión, características de la columna)
2.- identificar componentes de una mezcla (muestra problema) mediante comparación de tr.
3.- calcular parámetros cromatográficos
4.- realizar estudio del efecto de variación de condiciones de trabajo sobre los parámetros cromatográficos.
- flujo (0.5, 0.8, 1.2 ml/min)- composición de fase móvil Metanol/agua(70/30, 80/20)
5.-cuantificacion de los componentes de la muestra problema mediante calibración externa (curva de calibración)






RESULTADOS

Análisis cualitativo

1. Estudio del flujo

Condiciones:
Longitud de onda: 254nm
Fase Movil: 70% metanol: 30% agua

Se realizo a 0.5, 0.8 y 1.2ml/min

Tabla Nº 1: valores de los componentes dela muestra problema al cambiar el flujo


Flujo (ml/min)
Presion (bar)
t r (min)
t r (cm)
wb (cm)
Resolución
Compuesto 1
0.8
44
1.07
1.15
0.15
3.45
Compuesto 2
0.8
44
2.12
2.1
0.4








Compuesto 1
0.5
35
1.76
1.75
0.45
3.2
Compuesto 2
0.5
35
3.45
3.35
0.55








Compuesto 1
1.2
57
0.73
0.75
0.25
2.36
Compuesto 2
1.2
57
1.42
1.40.30


El flujo elegido para la separación de los analitos de la MP 27 es el de 0.8ml/min ya que con el se obtuvo un mayor resolución


2. Estudio de la Fase Móvil

Condiciones:
Longitud de onda: 254nm
Flujo: 0.8ml/min

Tabla Nº 2: valores de los componentes de la muestra problema al cambiar la fase movil

Fase Movil: 80%metanol : 20%agua

Fase Movil: 70%metanol : 30%agua


t r(min)
t r (cm)
wb (cm)
Rs
t r (min)
t r (cm)
wb (cm)
Rs
Compuesto 1
1.06
1.1
0.2
2.00
1.07
1.15
0.15
3.45
Compuesto 2
1.67
1.6
0.3

2.12
2.1
0.4


La fase móvil elegida para realizar el análisis fue la de 70%metanol : 30%agua ya que al comparar los valores obtenidos es la que posee mayor resolución.


3. Estudio del cambio de la longitud de onda

Condiciones:...