Determinaciones Enzimaticas

INSTITUTO DE HEMATOPATOLOGIA
Laboratorio de enzimas lisosomales
Determinaciones enzimáticas



HURLER-SCHEIE:

Procedimiento:

1.- En un tubo de ensaye colocar 15 μl de p-nitrofenol-iduronato 10 mM en solución amortiguadora de formiato de sodio 0.4 M conteniendo NaCl 0.15 M, pH 3.5, adicionar 60 μl de lisado de leucocitos (50-150 μg). (Ver Preparación de sustratos).

2.- Incubar 8horas a 24 ° C.

3.- Transcurrido el tiempo agregar 250 μl de reactivo de fenol; el color se desarrolla con 0.4 ml de Na2CO3. al 12 %.

4.- Leer en espectrofotometro a 410 nm Zeiss.




SAN FILIPPO B:

Procedimiento:

1.- Colocar dentro de un tubo de ensaye: 50 μl del sustrato 4-Metilumbeliferil, 2-acetamido-2-deoxi-α−glucopiranósido 2 mM, 25 μl de acetato de sodio 0.2 M pH 4.3, con25 μl de suero del paciente a estudiar. (Ver Preparación de sustratos).

2.- Incubar 2 horas a 37° C.

3.-Transcurrido el tiempo adicionar 1.8 ml de la solución amortiguadora de glicina-carbonato (glicina 0.32 M, bicarbonato de sodio 200 mM pH 10.4). (Para parar la reacción).

4.- Leer en espectrofluorometro a 370 nm de emisión y 460 nm de absorción. Aminco.





INSTITUTO DEHEMATOPATOLOGIA
Laboratorio de enzimas lisosomales
Determinaciones enzimáticas




MORQUIO:

Procedimiento:

1.- Colocar en un tubo de ensaye: 200 μl del sustrato 4-metilumbeliferil β- galactosido 2 mM en solución amortiguadora de fosfato de sodio 20 mM y acido cítrico 14 mM ajustada a pH de 4.0, mas 100 μl de lisado de leucocitos (50-100 mg de proteína celular) y 100 μl de cloruro de sodio0.2 M. (Ver Preparación de sustratos).

2.- Incubación de 1 hora a 37° C.

3.- Al termino de la incubación adicionar 1.8 ml de solución amortiguadora de glicina-carbonato (glicina 0.32 M, carbonato de sodio 0.20 M, pH 10.4) (Para parar la reacción).

4.- Leer en espectrofluorometro a 370 nm de emisión y 460 nm de absorción. Aminco.



MAROTEAUX –LAMY:

Procedimiento:

1.- Colocar enun tubo de ensaye lo siguiente: 500 μl del sustrato p-nitrocatecol-sulfato 50mM en solución amortiguadora de acetato de sodio 200 mM y acetato de bario 10 mM, pH 4.8, y 100 μl de lisado de leucocitos. (Ver Preparación de sustratos).

2.- Incubar la solución 30 y 90 min. a 37° C.

3.- Transcurrido este tiempo añadir 0.6 ml de hidróxido de sodio 0.1 N (Para parar la reacción).

4.- Leer enespectrofotómetro a 515 nm. Zeiss.



INSTITUTO DE HEMATOPATOLOGIA
Laboratorio de enzimas lisosomales
Determinaciones enzimáticas




SLY:

Procedimiento:

1.- Colocar en un tubo de ensaye lo siguiente: 100 μl de 4-Metilumbeliferil-β, D-glucorónido 10 mM en acetato de sodio 0.1 M, pH 4.8, y 25 μl de suero. (Ver Preparación de sustratos).

2.- Incubar 30 minutos a 37° C.

3.-Transcurrido el tiempo agregar 1.8 ml de buffer glicina-carbonato (Para parar la reacción).

4.- Leer en espectrofluorometro con emisión de 370 nm, absorción 460 nm. Aminco.



MANOSIDOSIS:


Procedimiento:

1.- Colocar en un tubo de ensaye lo siguiente: 100 μl de metilumbeliferil-α-D-manopiranósido 1 mM en solución amortiguadora de fosfato/citrato 0.1 M, pH 4.0 y 200 μl de suero. (VerPreparación de sustratos).

2.- Incubar 30 minutos a 37 ° C.

3.- Transcurrido el tiempo agregar 1.7 ml de buffer glicina-carbonato (Para parar la reacción).

4.- Leer en espectrofluorometro con emisión de 370 nm, absorción 460 nm. Aminco.







INSTITUTO DE HEMATOPATOLOGIA
Laboratorio de enzimas lisosomales
Determinaciones enzimáticas




LEUCODISTROFIA METACROMÁTICA:Procedimiento:

1.- Colocar en un tubo de ensaye lo siguiente: 200 μl de suero con 500 μl del sustrato p-nitrocatecol sulfato 10 mM, amortiguada a pH 5.0. (Ver Preparación de sustratos).

2.- Incubar 4 hrs. A 37° C.

3.- Transcurrido el tiempo agregar 600 μl de Hidróxido de sodio 1 N (Para parar la reacción).

4.- Leer en espectrofotómetro a 515 nm. Zeiss.




GANGLIOSIDOSIS GM1:...