Determinación De Actividad De Succinato DeshidrogEnasa En Escherichia Coli”

Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Laboratorio de Bioquímica Microbiana
Químico Bacteriólogo Parasitólogo



“Práctica No.3 Determinación de actividad de succinato deshidrogenasa en Escherichia coli”


Equipo: 1

Sección: 1

Integrantes:


Grupo: 6QM3


Profesoras:

Susana Alfaro Aguilar
Odilia García AquinoAnnabel Romero Hernández
Antonia de Lira Torices


Fecha de entrega: 15 Marzo 2012

HIPÓTESIS
Debido a que la glucosa es transportada al interior de la bacteria de manera más rápida que el succinato, se obtendrá un mayor crecimiento de Eschericia coli al cultivarla con glucosa que con succinato.
En base al hecho de que la succinato deshidrogenasa es una enzima regulable1, su actividad se veráafectada de acuerdo con la fuente de carbono (glucosa o succinato) en que se desarrolle el microorganismo, y la fuente de carbono que se le adicione posterior a su crecimiento.

DESARROLLO EXPERIMENTAL
Se tomó una asada de una cepa de E. coli silvestre colocandola en dos porciones de 50 mL de medio Shyper-Strauss, a cada matraz se adicionó glucosa al 1% y en el otro succinato al 0.5%; esto se incubópor 12 a 37°C en agitación, más tarde centrifugamos el contenido de los matraces desechando el sobrenadante, el paquete celular lo resuspendimos y lavamos 2 veces con regulador de fosfatos para llevarlo a un volumen final de 10mL con regulador de fosfatos.
Procedemos a realizar una serie de tubos con los tratamientos succinato/glucosa, succinato/succinato, glucosa/glucosa y glucosa/succinatodespués de cada cultivo tomamos una alícuota de 4 mL y la leemos a 600 nm contra un testigo sin inoculo, esta es la lectura a tiempo inicial de incubación. Más tarde incubamos por 5 horas a 37°C y volvemos a leer es un espectrofotómetro a 600 nm tanto los problemas como el testígo, para después centrifugar y lavar el paquete celular con regulador de fosfatos.
Al agregar el cianuro de potasio loque se ocasionó fue el bloqueo selectivo del complejo IV (Citocromo oxidasa) por lo que la concentración de protones buscará igualarse usando otro medio que sería el complejo III en el cual se encuentra unido el 2,6 diclorofenol indofenol a la ferredoxina y este al encontrarse en un estado oxidado (cuyo color es azul) y su absorbancia máxima es a una longitud de 600 nm se reducirá al aceptar loselectrones (volviéndose incoloro) que anteriormente fueron transferidos al metasulfato de fenazina, el cual acelera este proceso al recibir los electrones de la CoQ que se le transfirieron del FADH2 al oxidar el succinato a fumarato por la SDH. Así, se lee el % de transmitancia a 600nm, debido a la disminución de color, contra un blanco de regulador de fosfatos.

OBJETIVOS
Construir una cadenaartificial de electrones en Eschericia coli cultivada bajo diferentes condiciones para así determinar la actividad enzimática de succinato deshidrogenasa y en base a ésta y a su crecimiento analizar la función fisiológica de la enzima en E. coli.

REGISTRO DE DATOS

Tabla 1. Efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de E. coli.
Cultivos previos en | Matraces con medio base | Fuente de C |Crecimiento (absorbencia 600nm) | ∆ Absorbencia |
| | | Inicial | Final | |
Succinato | 1 | Succinato | 0.759 | 1.095 | 0.336 |
| 2 | Glucosa | 0.76 | 1.235 | 0.475 |
Glucosa | 3 | Succinato | 0.783 | 1.143 | 0.360 |
| 4 | Glucosa | 0.795 | 1.281 | 0.486 |

Tabla 2. Efecto de la fuente de carbono en la actividad de succinato deshidrogenasa en E. coli.
Tiempo (seg) | % transmitancia a 600nm de las suspensiones celulares crecidas en las fuentes de carbono: |
| 1 Succinato/succinato | 2 Succinato/glucosa | 3 Glucosa/succinato | 4 Glucosa/glucosa |
0 | 14.8 | 15.9 | 15.1 | 15.9 |
30 | 17.8 | 19.8 | 16.1 | 19.1 |
60 | 21.3 | 21.7 | 17.0 | 22.2 |
90 | 25.2 | 24.6 | 17.9 | 24.0 |
120 | 29.1 | 26.1 | 18.6 | 25.4 |
150 | 32.2 | 26.7 | 19.3 | 26.5 |
180 | 34.5 | 27.6 | 19.8 |...