Determinación de actividad enzimática enzimas digestivas.

Laboratorio n° 4:

Determinación de actividad enzimática: enzimas digestivas.



Introducción

Las enzimas son catalizadores proteicos que aceleran la velocidad de las reacciones metabólicas que ocurren tanto a nivel celular como fuera de ellas, sin sufrir ellas cambios en su estructura y/ofunción.
En el proceso de la digestión, las biomoléculas ingeridas en la dieta deben ser degradadas a sus componentes más sencillos para ser absorbidas a nivel del tubo digestivo y así llegar al lugar correspondiente a nivel celular donde participarán en diversos procesos metabólicos indispensables para el mantenimiento de una adecuada homeostasis. La digestión de los carbohidratos comienza en la boca,donde los alimentos se mezclan con alfa amilasa salival. La alfa amilasa es una enzima hidrolasa activada por iones de cloruro, que degrada al azar los enlaces alfa 1,4 del almidón de todo alimento. La alta concentración de protones presentes en el estómago inactiva esta enzima y el almidón se sigue digiriendo en el intestino delgado gracias a la alfa amilasa pancreática. Esta enzima degrada elalmidón liberando maltosa, maltotriosa y dextrinas.
Para medir la actividad de la enzima alfa amilasa, el almidón y dextrinas complejas son tratadas con una solución de yodo, las cuales dan un complejo de coloración azul. Mientras que la maltosa y dextrinas simples al ser tratadas con una solución de yodo producen una reacción negativa incolora. La decoloración del complejo azul hasta alcanzar elpunto acrónimo (solución incolora) nos permitirá medir la actividad de esta enzima.
Para detectar la maltosa y carbohidratos reductores se utiliza el Test de Benedict. Este es un método cualitativo que se fundamenta en un medio alcalino, en el cual el ión cúprico (otorgado por el sulfato cúprico) es capaz de reducirse por efecto del grupo aldehído del azúcar (CHO) a su forma de Cu+. Este nuevoion se observa como un precipitado rojo ladrillo correspondiente al óxido cuproso (Cu2O).
Cabe destacar que existen formas de identificar y cuantificar azúcares reductores, tales como por Ensayos de Somogyi-Nelson y por el método químico de la o-toluidina.
Por otro lado, los lípidos de la dieta (triglicéridos, esteroles y fosfolípidos de membrana) son degradados de forma incompleta en elduodeno gracias a la secreción pancreática. La lipasa pancreática es una enzima ubicua que se usa en el organismo para disgregar las grasas de los alimentos de manera que se puedan absorber. Su función principal es catalizar la hidrólisis de triacilglicerol a diglicerol, monoglicerol, glicerina y ácidos grasos. Esta hidrólisis ocurre en las interfase H2O / aceite de las gotitas de lípidos finamenteemulsificadas, formadas por la agitación mecánica en el intestino en presencia de sales biliares. La disociación de los ácidos grasos formados a través del tiempo de la reacción produce un cambio de pH, el cual nos permite seguir la reacción ocupando un indicador ácido-base como el rojo de fenol (ácido débil con un intervalo de transición entre valores de pH 6,4 y 8,0).
Al agregar el indicador rojode fenol, este sufre un cambio de coloración que va de rojo a amarillo, lo que nos indica que de un pH básico (forma desprotonada) se pasa a un pH ácido (forma protonada).

Objetivos

Generales:

1) Determinar la actividad enzimática de la enzima digestiva amilasa pancreática.
2) Determinar la actividad enzimática de la enzima digestiva lipasa.
3) Estimar semicuantitativamenteel almidón a distintos tiempos de la hidrólisis enzimática del almidón.
4) Estimar azúcares reductores mediante la prueba o reacción de Benedict a distintos tiempos de ocurrida la reacción.
5) Degradar triglicéridos mediante la utilización de lipasa pancreática.

Específicos:

1) Estudiar el papel de la Amilasa Salival en el proceso de digestión de los
Carbohidratos.
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