Determinación de la actividad de la formiato deshidrogenasa y nitrato reductasa en escherichia coli

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

BIOQUÍMICA MICROBIANA
LABORATORIO
PRÁCTICA No.4
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA FORMIATO DESHIDROGENASA Y NITRATO REDUCTASA EN Escherichia coli
SECCIÓN 1 EQUIPO 3
* CARREON DIAZ RUBEN RODRIGO
* CAMACHO GARCIA JÓSE FRANCISCO
* ACOSTA AGILAR ISIS LIZETH
* IBARRA RODRÍGUEZ JAIME IVAN
6QM1

OBJETIVOS:
Analizar la actividad de laformiato deshidrogenasa, nitrato reductasa y del complejo formiato deshidrogenasa-nitrato reductasa en Escherichia coli, a partir de cultivos diferentes con condiciones distintas .De los datos que se obtengan analizar y discutir cómo es que se comporta Escherichia coli en cada uno de los cultivos empleados.
Evaluar la respiración aerobia y la respiración con nitrato en condiciones anaerobias decrecimiento de Escherichia coli y cuando se le agrega nitrato de potasio y oligoelementos.
HIPOTESIS:
FUNDAMENTOS:
a) Cuantificación de nitritos
Se lleva a cabo en un medio ácido (HCl), donde el nitrato reacciona con la sulfamida para producir una sal de diazonio, la cual reacciona a su vez con el dicloro de N-naftol, 1-Etilendiamonio(N-NFDA), una amina aromática, para dar lugar a uncompuesto rosa, de intensidad proporcional a la [NO2-].
b) Método de Lowry
Es una modificación del método de Folin-Ciocalteau, basado en la presencia de tirosina y triptófano en las proteínas.
Cuando se agrega el reactivo de Folin a una proteína, está se reduce a un complejo azul de molibdeno por la oxidación de los aminoácidos tirosina, triptófano, cisteína, cistina e histidina.
DESARROLLOEXPERIMENTAL
Obtención de los cultivos
Se obtuvo un cultivo de E. Coli a partir de un medio de cultivo adicionado de glucosa como la fuente de carbono para la bacteria .A partir de este cultivo se prepararon cuatro matraces adicionado con o sin nitrato de potasio(que actúa como un aceptor de electrones en la cadena respiratoria)y oligoelementos(Fe ,Mo, Se que actúan como cofactores, además sonlas sales con que se requieren para el crecimiento),bajo distintas condiciones de anaerobiosis o aerobisis que modificaran la síntesis o la actividad de la Nitrato reductasa, así como el resto del complejo .
Posteriormente se obtiene los sustratos enzimáticos a partir de las suspensiones previamente preparadas en los matraces, para ello se cosechan centrifugación y se resuspenden en reguladorTMK-20 adicionado con sacarosa al 20% que es empleada para plasmolizar las células y lisozima para romper las paredes celulares, para finalizar se les da un tratamiento de choque térmico para terminar de fragmentar las células y se elimina la viscosidad empleando un regulador de fosfatos que contenga DNasa.
Para evaluar la actividad de la Formiato Deshidrogenasa se midió con diferentes aceptoresde electrones (2,6-diclorofenol indofenol; formiato de sodio; metosulfato de fenazina) mediante la utilización de un ensayo espectrofotométrico
La actividad de nitrato reductasa se midió empleando KNO3 como aceptor de electrones; benzil viológeno aceptor de electrones y regulador de fosfatos para regular el pH, además se paso una corriente de nitrógeno para generar las condiciones anaeróbicasdel medio; demás de oxidar al oxigeno para la formación de nitritos, permite la activación de la nitrato reductasa, se adiciono hidrosulfito de sodio que actúa como donador de electrones, para que se lleve a cabo la reacción enzimática. Para obtener menos oxidado el espectro reducido se destapa el frasco y se agita vigorosamente.
Y finalmente mediante un ensayo espectrofotométrico se cuantificanlos nitritos liberados.
Para determinar la actividad del complejo formiato deshidrogenasa-nitrato reductasa se midió empleando KNO3 como aceptor de electrones, la aplicación de la corriente de nitrógeno para generar las condiciones anaeróbicas del medio; demás de oxidar al oxígeno para la formación de nitritos, permite la activación del complejo, se inyección de formiato de sodio que actúa...