Determinación del punto isoeléctrico de una proteína

1. Objeto y campo de aplicación.
Determinar el punto isoeléctrico de una proteína, la caseína.
2. Referencia a la norma.
Apuntes proporcionados por la profesora de Biotecnología.
3. Definiciones.
Las proteínas son polímeros lineales constituidos por unos monómeros conocidos como aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos.
Los aminoácidos son metabolitos energéticos queconstituyen las proteínas, muchos de ellos importantes desde el punto de vista nutricional.
El enlace peptídico es un enlace covalente entre el grupo amino (–NH2) de un aminoácido y el grupo carboxilo (–COOH) de otro aminoácido.
El punto isoeléctrico es el pH al que una sustancia tiene carga neta cero.
4. Fundamento teórico.
En la leche hay tres clases de proteínas: caseína, lacto albúminas y lactoglobulinas, todas ellas globulares. La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada negativamente y solubilizada como sal cálcica. Si se añade ácido a laleche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita:
Ca2 + Caseinato + 2HCl  Caseína + CaCl2
Se debe tener en cuenta que todas las macromoléculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se dispersan en agua. Una característica de las proteínas es que la carga total que adquieren depende del pH del medio.Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos. Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente ácido debido a que los grupos COOH de los aminoácidos aspártico y glutámico estarían en su forma neutra pero los grupos amino de Argininay lysina estarían protonados (-NH3+). De igual forma si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto estaría cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estarían desprotonados (COO-) y los grupos amino estarían en su forma neutra (NH2).
De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero. A este pH se le denomina puntoisoeléctrico (PI). En el punto isoeléctrico se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación.
5. Identificación de la muestra.
Disolución de caseína en acetato de sodio 0.1N preparada por el grupo 2 a partir de leche desnatada “Hacendado”.
6.Condiciones del ensayo.
Para llevar a cabo el ensayo no han sido requeridas condiciones especiales.
7. Reactivos.

 Ácido acético (CH3COOH) “PANREAC” al 100%; 60.05 g/mol.
 Hidróxido sódico “DIRANZO” para profesionales.
 Agua destilada.

8. Aparatos y material empleados.

 Gradilla.
 9 tubos de ensayo de vidrio pequeños, “PYREX”.
 Pipeta graduada de 10ml tipo A “SCHARLAN”.
 Pipetagraduada de 10 ml tipo B “CUALICOLOR”.
 Permanente.
 Espectrofotómetro BIOWAVE DNA/WPA.
 Cubetas de espectrofotómetro de 1cm de paso óptico.
 Prepipeta.
 Pipeta Pasteur.

10. Cálculo y expresión de los resultados.
Tabla de resultados.
Tubo Al añadir Caseína A los 25 min Absorbancia
(A) pH
Blanco - - 0.000 -
1 Poco turbio No hay cambios 0.043 3.5
2 Poco turbio No hay cambios 0.121 3.83 Poco turbio No hay cambios 0.133 4.1
4 Poco turbio No hay cambios 0.120 4.4
5 Poco turbio Nube blanca en el medio del tubo
y muy poco precipitado en suspensión 0.144 4.7
6 Poco turbio Nube blanca en el medio del tubo
Y muy poco precipitado en suspensión 0.145 5.0
7 Poco turbio Nube blanca en el medio del tubo 0.074 5.3
8 Poco turbio Nube blanca en el medio del tubo 0.032 5.6
9 Poco...