Diagnostico molecular

Técnicas de Diagnóstico
Molecular
CURSO DE VIROLOGÍA 2012

Vet. Danilo Bucafusco
dbucabusco@fvet.uba.ar

Objetivos de la Clase:
Comprender porque la PCR es una técnica de
suma utilidad en el diagnóstico virológico
Reconocer la importancia de conocer los
aspectos biológicos del virus y la patogenia de la
enfermedad para obtener los máximos beneficios
de estas tecnología
Observar yanalizar los resultados obtenidos
mediante la aplicación de PCR en enfermedades
virales de interés veterinario.
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PCR

DEFINICIÓN
AMPLIFICACIÓN DE LA CANTIDAD DE
MOLÉCULAS DE ADN DE UNA
SECUENCIA DETERMINADA PARA
LOGRAR NIVELES TALES QUE ME
PERMITAN SU MANIPULACIÓN / ANÁLISIS

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PCR :
FUNDAMENTO

PCR :

FUNDAMENTO

Características de los virus importantes para sudiagnóstico molecular

¿simpleza o complejidad genética?

Poco tamaño
Escasa cantidad de secuencias regulatorias y/o no codificantes
Muchas diferencias entre familias
Genomas ARN o ADN
Altos contenidos de Gs y Cs (Herpes)

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Características de los virus importantes para su diagnóstico molecular

•Alta capacidad replicativa

• No requiere aislamiento previo ni
adaptación al cultivo•Puedo detectar virus intra o extracelular

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Características de los virus importantes para su diagnóstico molecular
Por defectos en la capacidad editora de las polimerasas virales:

• Alta capacidad evolutiva
•Alta proporción de partículas defectivas

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9

ESPECIFICIDAD ANALÍTICA
DEPENDE PRINCIPALMENTE DE LOS PRIMERS Y SU CAPACIDAD DE
COMPLEMENTARSE UNICAMENTE CON NUESTRASECUENCIA DE
INTERÉS

SENSIBLILIDAD ANALÍTICA
CANTIDAD INICIAL DE MOLÉCULAS NECESARIA PARA OBTENER UN
NIVEL DE AMPLIFICACIÓN ADECUADO A NUESTROS REQUERIMIENTOS
TEORICAMENTE A PARTIR DE UNA ÚNICA MOLÉCULA PUEDEN
GENERARSE MILLONES DE COPIAS

PCR como herramienta diagnóstica

VENTAJAS
•ALTA ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD ANALÍTICAS
•DIAGNÓSTICO RÁPIDO
•MENORES REQUERIMIENTOS DE CONSERVACIÓNDE LA MUESTRA
•DETECCIÓN DE PATÓGENOS INACTIVO O LATENTES
•DETECCIÓN DE PATÓGENOS DE CRECIMIENTO DIFICIL
•ESTUDIOS RETROSPECTIVOS
•FACIL ACCESO A LOS REACTIVOS
•DISEÑO DIRIGIDO DE LOS PRIMERS

DESVENTAJAS
•NECESIDAD DE CONOCER ALGUNA SECUENCIA DEL AGENTE
•POSIBILIDAD DE PRESENCIA DE INHIBIDORES DE LA REACCIÓN
•LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
•REACTIVOS DE ALTO COSTO (?)
•SÓLO DETECTALA PRESENCIA DEL PATÓGENO (no siempre
causalidad)
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Muestra: Consideraciones
Tamaño de muestra mínimo (por lo general)
Conservación: lo mas importante es prevenir LA DEGRADACIÓN
DEL ÁCIDO NUCLEICO por parte de las nucleasas presentes en la
muestra. (RNAsas mas resistentes y ubicuas que DNAsas)
• FRÍO (cuanto mas, mejor)
• Deshidratación
No requiere mantener la viabilidad del patógenoni la integridad
celular
ALTO RIESGO DE CONTAMINACIÓN CRUZADA EN EL MOMENTO
DE LA TOMA (debido a la alta sensibilidad)

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ETAPAS DE UNA PCR
PREPARACIÓN
DEL “MIX” DE
COMPONENTES
ELECTROFORESIS

TERMOCICLADO

EXTRACCIÓN o
PURIFICACIÓN DE
AN

VISUALIZACIÓN
DEL PRODUCTO

PCR DIAGNÓSTICA

PREPARACIÓ DEL “MIX”

COMPONENTES PRINCIPALES
PRIMERS
DNTPs
ENZIMA POLIMERASABUFFER PARA LA ENZIMA
MgCl2
H20
ADN de la Muestra

PCR DIAGNÓSTICA

ELECTROFORESIS

PCR DIAGNÓSTICA

VISUALIZACIÓN DEL AMPLICÓN E INTERPRETACIÓN

TRANSILUMINADOR

RT-PCR

PRINCIPALES APLICACIONES DE PCR
DETECCIÓN DE AGENTES INFECCIOSOS (VIRUS BACTERIAS - HONGOS - PARÁSITOS)
DETECCIÓN DE CONTAMINANTES (EJ: ALIMENTOS)
MAPEO DE GENES O MUTACIONES
GENERACIÓN DE ORGANISMOSTRANSGÉNICOS
MUTAGÉNESIS “IN VITRO”
INVESTIGACIONES FORENSES
ARQUEOLOGÍA MOLECULAR

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Técnicas de Diagnóstico Molecular

SECUENCIACIÓN

Que es secuenciar ?
Determinar la secuencia de nucleótidos
que contiene una molécula de ADN

Metodología:

El método mas frecuentemente
utilizado es el método de Sanger

O

OH

N

H

O

NH

CH2
O
OH

P

O

N
2...