Diagrama De Flujo De Pcr

PCR
OBTENCION DEL ADN.








































































PRIMERA SESIÓN:

PROCEDIMIENTO PARA AISLAR ADN DE LA COLONIA SOSPECHOSA DEL MICROORGANISMO. Preparación de ADN genómico bacteriano.

Protocolo básico: Minipreparación (miniprep) de ADN genómico por el método de fenolcloroformo. (Se incluye como referencia, ya que en la práctica utilizaremos el método comercial).



Materiales

Buffer Tris EDTA (TE)

Dodecil sulfato de sodio (SDS) 10% p/v

Lisozima

RNasa

NaCl 5M

Solución CTAB/NaCl

Cloroformo:alcohol isoamílico 24:1

Fenol:cloroformo:alcohol isoamílico 25:24:1

Isopropanol

Etanol 70%


NOTA: Es obligatorio utilizar guantes a lo largo detodo el protocolo


METODOLOGÍA

1. Crecer un cultivo bacteriano en 5 mL de medio, a saturación. Microcentrifugar 1.5 mL del cultivo por dos minutos

2. Resuspender el pellet en 567 μL de buffer TE. Agregar 30 μL de SDS 10 %, una punta de espátula de lisozima y 5 μL de RNasa, mezclar e incubar 1 h a 37°C.

3. Agregar 100 μL de NaCl 5M y agitar vigorosamente. Agregar 80 μLde CTAB/NaCl, mezclar e incubar 10 min a 65°C. Los polisacáridos y otras macromoléculas contaminantes pueden ser removidos iniciando el protocolo con este paso.

4. Agregar un volumen igual de cloroformo:isoamílico, mezclar en vórtex 15 segundos y microcentrifugar 5 min. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Si es difícil remover el sobrenadante, eliminar primero la interfase, con unpalillo de dientes.

5. Agregar un volumen igual de fenol:cloroformo:isoamílico, mezclar y microcentrifugar 5 min. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Para algunas cepas bacterianas, la interfase que se forma después de la extracción con fenol:cloroformo no es lo suficientemente compacta para permitir su extracción fácilmente. En tales casos, la mayor parte de la interfase puede serremovida con un palillo de dientes antes de remover el sobrenadante. Cualquier cantidad de CTAB/NaCl contaminante es removida en este paso de extracción con fenol:cloroformo.

6. Agregar 0.6 vol de isopropanol y mezclar suavemente por inversión hasta que el ADN precipite. Transferir el precipitado con una pipeta Pasteur sellada, a un tubo con 1 mL de etanol al 70 % y lavar.Alternativamente, el precipitado puede ser centrifugado y lavado con 1 mL de etanol al 70%.

7. Microcentrifugar 5 min, descartar el sobrenadante y secar el ADN. Resuspender en TE o en agua libre de nucleasas. El ADN está listo para usar; se recomienda almacenar a – 20 °C.



Obtención de ADN genómico por el método de kit comercial.

Se utilizará el Kit de aislamiento de DNA cromosomal bacteriano deMoBio Lab Inc. Todos los materiales vienen en el mismo.



1. En un tubo de colecta de 2 mL poner 1.8 mL del cultivo en estudio y centrifugar a 10,000 x g por 30 segundos, a temperatura ambiente y remover el sobrenadante con una punta de micropipeta. Es importante compactar el paquete celular y remover el sobrenadante con una punta de micropipeta.

2. Resuspender el pellet celular en300 μL de la solución “MicroBead solution” y mezclar mediante vórtex ligero. Transferir las células resuspendidas a un tubo “MicroBead Tube”. Esa solución contiene sales y un buffer para estabilizar y dispersar homogéneamente las células microbianas, antes de hacer la lisis.

3. Adicionar 50 μL de la solución “MD1” al tubo MicroBead. Esta solución contiene SDS y otras sustancias para lalisis. Puesto que el SDS precipita al enfriar, se puede calentar a 60°C para disolverlo sin dañarlo ni alterar los demás componentes de la solución.

4. Asegurar los tubos en una base de vórtex adecuada y mezclar a máxima velocidad por 10 min. Este paso crea las condiciones químicas/mecánicas combinadas de lisis que se requieren para liberar los ácidos nucleicos de las células. Para una buena...