Diagrama Lac

Tabla 1. Preparación del gel discontinuo de Poliacrilamida

Concentración final de acrilamida (%T) | Gel Separador(10.0%) | Gel Empacador(4%) |
Solución A (mL) | 4.5 | 1.5 |
Solución B (mL) |1.65 | -- |
Solución C (mL) | -- | 1.5 |
SDS 10% ( µL) | 135 | 111 |
Persulfato de amonio 0.3 % (mL) | 7.35 | 8.1 |
Volumen final (mL) | 13.50 | 11.1 |

A) Preparación del gelseparador-SDS 0.1%.

Mezclar las soluciones indicadas en la tabla 1, evitando la formación de burbujas, e inmediatamente colocar la mezcla entre las placas (del marco formado previamente) hasta llenar 3/4partes, agregar lentamente 1 mL de agua destilada hasta cubrir la superficie del gel. Esperar el término de la polimerización, que dura entre 20 y 30 min, después de añadido el persulfato de amonio a lamezcla. Durante el proceso de polimerización debe evitarse la formación de burbujas, porque el oxígeno del aire, retarda este proceso.

B) Preparación del gel empacador –SDS 0.1%.
Mezclar lassoluciones como se indica en la tabla 1 y agregar la mezcla hasta el borde de las placas (de 1 a 2 mL aproximadamente), colocar el peine para formar los pozos. Dejar polimerizar de 20 a 40 min. Retirarel travesaño de la parte inferior del marco. Quitar el peine y eliminar la solución que no polimerizó.

C) Montaje de la cámara.
Colocar las placas con los geles polimerizados en la cámara deelectroforesis. Adicionar en el compartimiento de la cámara el regulador de desarrollo (solución D diluida 1:10) con SDS al 0.1 %, evitando que se formen burbujas de aire entre el regulador y el gelempacador.

D) Aplicación de la muestra.
Empleando micropipeta colocar, 25 µL de cada muestra en el pozo correspondiente. Debe tenerse cuidado de que la muestra no pase de un pozo a otro, de estemodo se evitan contaminaciones.

E) Desarrollo del gel.
Conectar los electrodos a la cámara electroforética a la fuente de poder. Encender la fuente de poder, aplicar una corriente de 100V...