Diaz

INFLUENCIA DE DIVERSO FACTORES EN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA ALFA-AMILASA SALIVAL
OBJETIVOS:
• Observar la influencia de la temperatura y el pH sobre una reacción enzimática
• Constatar la especificidad de las enzimas
• Examinar el efecto de los iones metálicos pesados sobre la actividad de la alfa-amilasa
FUNDAMENTO TEÓRICO:
Las enzimas con proteínas cuya función es catalizar las muydiversas reacciones que se llevan a cabo dentro de los organismos vivos. Su acción es específica y se afecta por factores tales como la temperatura y el pH del medio, la concentración de la enzima y de sustrato, la presencia o ausencia de cofactores y/o inhibidores, etc. En esta práctica se va a ensayar la acción de varios de los factores mencionados sobre la alfa-amilasa salival. El nombresistemático de esta enzima es 1,4-glucano-glucanohidrolasa y su código: 3.2.1.1 de la Unión Internacional de Bioquímica; hidroliza los enlaces glucosídicos α 1-4, que son los que unen a los retos de glucosa del almidón. El almidón es una mezcla de dos polisacáridos: amilasa y amilopeptina. La amilosa con el yodo da una coloración azul oscura que se comunica a todo el almidón. Esta propiedad permite seguirla acción de la α-amilasa sobre el almidón: a medida que este se va hidrolizando (ruptura de los enlaces glucosídicos α 1-4) el color azul va desapareciendo hasta llegar a un color amarillo ocre, característico de la solución de yodo, cuando la hidrólisis ha sido total:






MATERIALES Y REACTIVOS

2 beaker de 100 ml
Gradilla con 12 tubos de ensayo
Cinta de enmascarar
HieloTermómetro
Pipeta de 2 ml
Agitador de vidrio
Placa colorimétrica
Gotero
Mechero y placa
150 ml de suspensión de almidón
50 ml de reactivo de lugol
50 ml de solución amortiguadora de pH 3
100 ml de solución amortiguadora de pH 7
50 ml de solución amortiguadora de pH 10
10 ml de pepsina al 0,1 % (u otra enzima diferente a la amilasa)
10 ml de ureasa al 0,1 % (u otra enzima diferente a la amilasa)10 ml de cloruro de mercurio al 1 %
10 ml de nitrato de plomo al 1 %

METODOLOGIA

Preparación de la amilasa salival:
La persona que donara la amilasa salival debe enjuagarse la boca con agua corriente dos o tres veces haciendo buches para eliminar los restos de comida. Después de enjuagada la boca tome un bocado de unos 20 ml de agua destilada y manténgalo en la boca por espacio de 2minutos, después deposítelo en un beaker, repita este proceso otra vez, complete el volumen de los enjuagues hasta 50 ml con agua destilada. ESTA SOLUCION QUE EN ADELANTE SE DENOMINARA AMILASA SALIVAL, SERA LA QUE UTILICE PARA LA REALIZACION DE LAS DISTINTAS PARTES DE LA PRACTICA.

INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL

Tome 3 tubos de ensayo, previamente lavados, yrotule uno como 0, otro 40 y otro 100. En cada uno de ellos tome 1 ml de almidón al 0,5 %. El tubo 0 se coloca durante 10 minutos en un baño de hielo; el tubo 40 se deposita durante 10 minutos en un baño maría que tenga una temperatura entre 35 y 40 °C (controle la temperatura colocando o quitando el mechero, según la necesidad y utilice un termómetro para verificar la temperatura) el tubo 100 sedeposita durante 10 minutos en un baño maría que este en ebullición. Esto con el fin de que el contenido de los tubos adquiera la temperatura correspondiente. A cada tubo SIN RETIRARLO DEL BAÑO agregue 0,5 ml de amilasa salival. Se agitan bien los tubos y se dejan durante un minuto a las condiciones de temperatura antes señaladas.
En la placa colorimétrica deposite 2 gotas de lugol en trescavidades diferentes, rotule cada cavidad como 0, 40 y 100, y una vez que se hayan cumplido los tiempo antes señalados, deposite en la cavidad “0” cinco gotas del contenido del tubo 0, en la cavidad “40” cinco gotas del contenido del tubo 40 y en la cavidad “100” 5 gotas del contenido del tubo 100. Observe en cada cavidad el color producido. Anote sus observaciones. La temperatura ideal u óptima...