Digestion Por Enzimas

Digestión de adn por enzimas de restriccion

RESUMEN
Se hicieron digestiones sencillas

INTRODUCCION
Digestión con enzimas de restricción.
Una enzima de restricción (o endonucleasas de restricción) son enzimas que se unen a moléculas de DNA de doble cadena y lo fragmentan en sitios específicos de acuerdo a secuencias nucleotídicas reconocidas por cada una en forma particular.
Parautilizar una enzima de restricción es muy importante verificar las condiciones de reacción especificas como pH y concentración de sales (proporcionadas por el amortiguador de digestión)
El mecanismo de corte de DNA se realiza a través del ruptura de 2 enlaces fosfodiester en la doble hebra, lo que da lugar a dos extremos de DNA. Éstos pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) oCohesivos/escalonados.  
    Existen 3 tipos de enzimas de restricción:
1.      Tipo I y Tipo III:
a.      Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan).
b.      Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo.  Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o despúes de la secuencia quereconocen.
c.      Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.
2.         Tipo II:
a.      Sólo tienen actividad de restricción.
b.      Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen.
c.      Sólo requieren Mg++ como cofactor.
d.      No necesitan ATP.

Uno de los campos en los que eluso de enzimas de restricción ha tenido mayor implicación ha sido el diagnóstico de enfermedades genéticas relacionadas con cambios en la secuencia del ADN, ya sean mutaciones puntuales, inserciones o deleciones de fragmentos. Si éstas se producen en un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción, al producirse eliminarán o agregarán nuevos sitios de corte. Al aplicar esta enzima al gen deuna persona sana y una enferma se deberían observar distintas cantidades de fragmentos para cada caso en una electroforesis.
Electroforesis de DNA
La electroforesis es el proceso por el cual moléculas cargadas son forzadas a ir a través de una matriz debido a un flujo de corriente eléctrica.
Una molécula de DNA cortada con enzimas de restricción genera diferentes fragmentos.  Estos pueden serseparados en base a su tamaño utilizando un gel de electroforesis.
El gel puede estar hecho de agarosa o poliacrilamida:
La agarosa es un polisacáriso de galactosa y derivados de galactosa que se entrecruzan por puentes de hidrógeno.  Se puede variar el tamaño de los poros ajustando la concentración de agarosa.
Los geles de poliacrilamida son generados al mezclarse polímeros de acrilamida ybisacrilamida en una reacción catalizada por persulfato de amonio y TEMED.  El tamaño de los poros depende de la concentración de acrilamida y bisacrilamida. La matriz de poliacrilamida posee poros mas pequeños que la de agarosa, permitiendo la separación de fragmentos mas pequeños.
Los fragmentos de DNA migrarán a una razón inversamente proporcional al logaritmo de su tamaño o peso molecular.A mayor tamaño menor será la migración del fragmento y a menor tamaño mayor será la migración del fragmento.
El movimiento de los fragmentos de DNA va a producir un patrón de bandas, donde cada banda corresponde a un fragmento de un tamaño particular.
El tamaño de cada fragmento puede ser determinado utilizando un marcador o  una escalera de DNA cuyos fragmentos tienen pesos molecularesconocidos.
Este marcador sirve de control y migrará paralelo a las bandas de DNA que deseamos analizar.
Una mezcla de diferentes moléculas puede ser separada en base a
Tamaño de la molécula o masa.
  Forma o conformación del DNA (ej. DNA superenrollado migra mas que DNA lineal).
Tamaño de los poros del gel.
Magnitud de la carga neta de la molécula.

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPO

-Tubos...