digestion proteinas

DIGESTIÓN (EN GEL) DE PROTEÍNAS Y EXTRACCIÓN DE PÉPTIDOS:


LAVADO :

Añadir unos 30ul de agua a los cachitos de gel (1mm3), dejar un par de minutos y quitar el agua
Añadir unos 30ul deAnbik (NH4HCO3) 50 mM, dejar unos 5 minutos y quitar el sobrenadante
Añadir unos 50ul de ACN, vortear, dejar 5-10min.s y quitar el sobrenadante

REDUCCIÓN Y ALQUILACIÓN :

Añadir unos 50ul de DTT10mM (diluído en Anbik 100mM)
Incubar 20-25 min.s a 56ºC, con agitación constante
Dejar que las muestras se templen (a T.a.) y quitar el sobrenadante
Añadir 30 ul de IAA 55mM (preparada fresca enAnbik 100mM, 10mg de IAA en 1 ml de Anbik 100mM) y dejar incubar unos 20 min.s a T.a. en oscuridad
Quitar el sobrenadante, añadir 50ul de ACN, vortear y dejar actuar unos 10min.s
Quitar elsobrenadante y secar los geles (en Speed-Vac)

DIGESTIÓN :

Rehidratar los geles con 5-6ul de tripsina 12,5ng/ul *, recién diluída en Anbik 50mM
Incubar en hielo, unos 30 min.s
Quitar el sobrenadante(Si se incuba sin hielo no quitar exceso de Try porque eliminamos PEPTIDOS) y añadir 20-30 ul de Anbik 50mM (sin tripsina!!!!)
Incubar toda la noche a 37ºC
Transferir el sobrenadante a un eppendorfnuevo


EXTRACCIÓN :

Añadir 30ul de Ambik 25mM a los geles y dejar actuar 5 min.s
Añadir la misma cantidad de ACN, vortear y dejar otros 10-15min.s
Quitar el sobrenadante y juntarlo con elanterior
Repetir el proceso con TFA %0,1 (Añadir TFA, misma cantidad de ACN, vortear, incubar y juntar los sobrenadantes)
Llevar los sobrenadantes a sequedad (Speed-Vac) y guardar para posterioranálisis


CONCENTRACIÓN DE LA MUESTRA :

Resuspender las muestras en 15ul de TFA %0,1 y sonicar 10-15min.s
Pasar estos 15 ul por la columnita de purificación **
Lavar los péptidos retenidos en lacolumna con 10ul de TFA %0,1
Eluir los péptidos con 0,5ul de matriz (HCCA/2***) directamente a la placa MALDI



*Preparación de tripsina 12,5 ng/ul:

Suspender el vial (25ug) de tripsina...