Discusion Análisis de DNA plasmidico por enzimas de restricción (RFLP)

Biología Molecular

Análisis de DNA plasmidico por enzimas de restricción (RFLP)

Introducción

Uno de los avances más importante en los inicios de la biología molecular, fue el
descubrimiento de las endonucleasas de restricción, es decir de enzimas que pueden cortar el ADN y que tienen la ventaja de que lo cortan en sitios concretos. Fueron descubiertas en bacterias, y son enzimasque estas bacterias usan para destruir ADN que ingresa a ellas, por ejemplo ADN de virus bacteriófagos. En la actualidad estas tienen muchos usos: para la realización de mapas físicos, huella genética ó fingerprinting, búsqueda de polimorfismos tipo SNPs, AFLPs, RFPLs, utilización en pasos previos a la clonación…etc. Y multitud de aplicaciones más específicas que hacen muy versátiles en su uso.Objetivo:

A)Realizar una digestión por medio de la enzima de restricción ACC1 en 2 plásmidos de tamaño conocido.
B) Verificar que se trate de los mismo plásmidos.

Materiales y Métodos:

Digestion de los plasmidos por enzimas de restricción:

DNA de plasmido

a) Para El plasmido E7A2B en p.GEMT
H2O MQ = 2µL
Buffer 10X = 1 µLE7A2B ----6 µL
Acc I-------1 µL
10 µL

Hacer 2 repeticiones

b) Para El DNA plasmidico E7A2B pCDNA

H2O MQ = 5µL
Buffer 10X = 1 µL
E7A2B ----3 µL
Acc I-------1 µL
10 µL
Hacer 2 repeticiones




Para la preparación de la digestión del plasmido:: mezclar todos los reactivos en un tuboeppendorf..
Incubar durante 3 horas a 37 C

Para la preparación y electroforesis en gel de agarosa.

Material:

-Solución amortiguadora de Tris-Boratos-EDTA (TBE).
-Gel de agarosa al 1% en TBE con bromuro de etidio.
-soporte-
-peines-
-cámara de electroforesis-

• Sellar los bordes de un molde de plástico limpio y seco con cinta adhesiva o de
otro modo.
• Colocar el peine adecuado de modoque se formen pocillos
completos al añadir la solución de agarosa.
• Diluir tampón de TBE 10x y preparar la cantidad adecuada de tampón de TBE
0,5x para llenar la cubeta de electroforesis y preparar el gel
• Pesar la agarosa en polvo según lo indicado en el cuadro 2 y añadirla a una
cantidad apropiada de tampón de TBE 0,5x en un matraz de Erlenmeyer con
tapa suelta (normalmente 150 ml desolución de gel para un molde de 15 x 15
cm y 100 ml de gel para un molde de 15 x 10 cm).
• Calentar la mezcla en un horno microondas o al baño maría hasta que se
disuelva la agarosa (comprobar el volumen de la solución tras haberla
calentado).
• Enfriar la mezcla a 50 - 60°C y añadir bromuro de etidio (de una solución madre
de 10 mg/ml) hasta lograr una concentración final de 0,2 μg/ml ymezclar bien.
• Verter la solución en el molde y dejar que se forme el gel. La cantidad de gel
empleado debe corresponder a un grosor de aproximadamente 3 - 5 mm.
• Una vez completamente formado el gel, retirar cuidadosamente el peine y la
cinta adhesiva y colocar el gel en la cubeta de electroforesis.
• Añadir tampón de TBE 0,5x a la unidad de electroforesis de modo que el gel
quede cubiertopor una capa de aproximadamente 2 - 5 mm.
Cargar 10 μl de cada muestra en pocillos consecutivos y el ADN marcador
adecuado en las calles primera y última.
• Cerrar la tapa de la cubeta del gel y conectar los cables eléctricos para que el
ADN migre hacia el ánodo y aplicar una tensión de 5 - 10 V/cm.
• Hacer la electroforesis hasta que el cianol de xileno haya recorrido la distancia
adecuada através del gel (~ 40 - 60 minutos).
• Desconectar la corriente y retirar los cables y la tapa de la cubeta. Introducir el
gel en un transiluminador UV y fotografiarlo.
• Tirar el gel en el recipiente para residuos sólidos destinado al bromuro de etidio previsto a tal fin.

Resultados

(Fig 1) (Fig 2)

Fig 1 de izquierda a derecha: 3 y 4 carriles, E7-A2B en pcDNA , 6 carril...