Diseño experimental; práctica Bombeo de protones y Cadena de transporte de electrones

LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA CÉLULA II
PRACTICA 6
Estudio del bombeo de protones en levaduras. Efecto de inhibidores y desacoplantes de la cadena de transporte de electrones

Introducción
El metabolismo energético es la base de las funciones celulares. Una adecuada transferencia de electrones a través de una serie de reacciones redox garantiza la obtención de sustratosenergéticos necesarios para el óptimo funcionamiento de las células.
En la membrana interna mitocondrial se encuentra la cadena respiratoria, que está formada por proteínas que se ensamblan en complejos multiproteicos. El Complejo I ó NADH-deshidrogenasa recibe los electrones de la oxidación del NADH y los transfiere a la Coenzima Q, la cual se desplaza libremente a través de la membrana internamitocondrial. El Complejo II ó succinato deshidrogenasa se encarga de transferir los electrones del succinato a la Coenzima Q, sin translocar protones. El Complejo III o también llamado Citocromo-C-coenzima Q oxidoreductasa recibe los electrones de la Coenzima Q y los transfiere al Citocromo c, un transportador electrónico proteico móvil que se encuentra en el espacio intramembranal. Por último, elComplejo IV o Citocromo oxidasa, acopla la oxidación del citocromo c con la reducción del oxígeno molecular a agua. Las reacciones globales de los complejos I, II, III y IV son exergónicas. El transporte de electrones a través de los complejos I, III y IV esta acoplado a la formación de un gradiente electroquímico transmembranal. Este gradiente de protones libera la energía suficiente para que tengalugar la síntesis de ATP por la ATP-sintasa.
Inhibición del transporte electrónico (síntesis de ATP).
Hay 2 tipos de inhibidores: a) Inhibidores de la cadena de transporte electrónico y b) inhibidores de la síntesis de ATP. Se han descrito inhibidores específicos para cada uno de los complejos de la cadena como la rotenona, amital, malonato, cianuro, CO y azida. Si se bloquea la cadena de transporteelectrónico cesa el consumo de O2. Estos inhibidores han sido importantes para determinar el orden de los complejos en la cadena de transporte electrónico. Si no hay consumo de O2 no habrá gradiente de H+ y no se sintetizará ATP. Los inhibidores de la síntesis de ATP actúan sobre la ATP sintasa un ejemplo es la oligomicina,que bloquea la cadena y la síntesis de ATP.
Desacopladores: otrasmoléculas inhiben la síntesis de ATP desacoplándola de la cadena de transporte electrónico, y aunque no haya síntesis de ATP la cadena sigue funcionando. Un desacoplador deshace el gradiente de H+ sin parar la cadena. El más común es el 2,4-dinitrofenol que es soluble en la membrana y su grupo OH se puede disociar. Esto libera energía en forma de calor. Tanto el ATP como el ADP necesitan un transportadorpara salir y entrar de la matriz mitocondrial y este transporte está favorecido por el gradiente de H+. En la membrana interna de la mitocondria hay un transportador que a la vez que saca ATP mete ADP + Pi y esto está dirigido por el potencial de membrana. Los Pi entran gracias a un transportador que se mueve por un gradiente de concentración. Este transportador cotransporta H+ y Pi y aprovechala energía del gradiente para a la vez que se introduce H+ introducir Pi. Los desacopladores pueden ser fuente de calor para aumentar la temperatura de la célula. Esto es utilizados por neonatos y animales que hibernan. A esta proteína desacopladora se le llama termogenina.
Un método indirecto el cual se utiliza ampliamente para evaluar la funcionalidad mitocondrial es el desarrollado por Mosmannen 1983, el cual se basa en la reducción de MTT (Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol) por las deshidrogenasas mitocondriales. En términos generales, las sales de tetrazolio al reducirse pasan al estado formazán, el cual es un compuesto de color azul e insoluble en agua. El empleo de esta técnica nos permite evaluar la actividad de los complejos de la cadena respiratoria...