Distribución Intracelular De La Anexina A6: Implicaciones Funcionales

Tesi doctoral presentada per En/Na

Iñaki DE DIEGO MARTÍNEZ

amb el títol

"Distribución intracelular de la anexina A6: implicaciones funcionales"

per a l'obtenció del títol de Doctor/a en

MEDICINA

Barcelona, 17 de desembre del 2005.

Facultat de Medicina Departament de Biología Cel.lular i Anatomía Patològica

INTRODUCCIÓN I - GENERAL Dominios funcionales Modelos de actuaciónpropuestos en la fusión de membranas Modificaciones post-traduccionales Unión calcio-independiente a membranas Anexinas en el sistema endocítico Inserción en la membrana Actuación en el núcleo celular II - ANEXINA A6 Aspectos relativos a su estructura Funciones de la anexina A6 III - CLASIFICACIÓN DE LAS FUNCIONES DE LAS ANEXINAS IV - ANEXINAS Y COLESTEROL Receptores LDLR y SR-BI Colesterol ylipid rafts Señalización de Ras y MAPKs V - RESUMEN OBJETIVOS MATERIAL Y MÉTODOS - Purificación de proteínas - Pulldown GST-RBD - Lowry-SDS - Medidas de calcio intracelular - Preparación (diálisis) de las HDL - Obtención de HDL fluorescentes - Immunocitoquímica - Fraccionamiento celular - Immunoprecipitación - Ensayo de actividad Raf - Ensayo de binding de 125I-HDL - Microscopía Electrónica deTransmisión - Tratamientos y marcadores - TABLA DE ANTICUERPOS RESULTADOS - “Cholesterol modulates the membrane binding and intracellular distribution of annexin 6” - “High density lipoprotein-induced signaling of the MAPK pathway involves Scavenger Receptor Type BI-mediated activation of Ras” - “Annexin 6-mediated membrane recruitment of p120GAP modulates the activation of Ras and Raf-1” Análisis de latranslocación calcio-dependiente de la anexina A6 DISCUSIÓN CONCLUSIONES BIBLIOGRAFIA ANEXO I ANEXO II

001 003 004 010 012 014 015 020 022 022 022 026 033 036 037 042 044 048 051 055 057 059 062 063 066 067 068 070 072 073 076 078 080 083 087 091 105 113 157 173 197 201 219 235

ABC-A1 AMPc ANX APO ATP BSA CAPRI CD/ β-MCD CFP CHO CTB DAG DMSO EDG EDTA EEA-1 EGF EGFR eNOS ERK/MAPK FACS FCSFITC FRET GAPs GEFs GFP GPCRs GPI GST GTP HDL IGF2/MPR IP IPTG KLH LBPA LDL LDLR MAPKs MBP MEK/MAPKK MVBs NRK PBS PC PDGF PFA

ATP binding cassette – A1 cyclic adenosine monophosphate annexin apolipoprotein adenosine triphosphate bovine serum albumin calcium-promoted Ras inactivator β-methyl cyclodextrin cyan fluorescent protein chinese hamster ovary cholerae toxin B subunit diacylglyceroldimethylsulfoxide endothelial differentiation gene receptor ethylenediaminetetraacetic acid early endosomal antigen -1 epidermal growth factor epidermal growth factor receptor endothelial nitric oxid synthase extracellular signal regulated kinase / fluorescence-activated cell sorter foetal calf serum fluorescein isothiocyanate fluorescence resonance energy transfer GTPase activating proteins guaninenucleotide exchange factors green fluorescent protein G-protein coupled receptors glycosylphosphatidylinositol glutathione-S-transferase guanosine triphosphate high density lipoprotein insulin-like growth factor receptor 2 / mannose-6-phosphate receptor propidium iodide isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside keyhole limpet hemocyanin lisobisphosphatidic acid low density lipoprotein low densitylipoprotein receptor mitogen-activated protein kinases myelin basic protein mitogen activated protein kinase kinase mitogen activated protein kinase multivesicular bodies normal rat kidney phosphate buffered saline phosphatidylcholine platelet derived growth factor paraformaldehyde

VII

PH PI3-K PKB/AKT PKC PLA2 MARCKS PMSF PNS PS PTX PVDF QM RASAL RBD REB RTKs SDS-PAGE SPP SR-BI TCA TGN TPA TRITCU18666A VLDL W13 YFP

pleckstrin homology domain phosphoinositide 3-kinase protein kinase B protein kinase C phospholipase A2 myristoylated alanine-rich C-kinase substrate phenylmethysulfonylfluoride post-nuclear supernatant phosphatidylserine pertussis toxin polyvinylidene fluoride chilomicron ras GTPase-activating-like protein ras binding domain of Raf ras extraction buffer tyrosine kinase...