DNA RECOMBINANTE

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIAFACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE QUIMICA
FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA
MOLECULAR
EDILENE RAMÍREZ VARGAS
CODIGO: 174173

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El DNA se puede romper y
unir
(recombinar)
con
fragmentos de la misma
especie o de una diferente.
El
concepto
de
DNA
recombinante implica crear
voluntariamente moléculas
de DNA constituidas, a su
vez, por fragmentos de DNA
provenientes dediferentes
fuentes.
Para
recombinar
es
necesario cortar y después
unir
específicamente
el
DNA. Esta
manipulación
genética se efectuó en gran
parte usando enzimas que
actúan sobre el DNA, como
las
endonucleasas
de
restricción y las ligasas.

•

Durante el decenio de 1970 se encontró que las
bacterias contenían nucleasas que reconocían
secuencias cortas de nucleótidos dentro de un DNA
doble ydividían la columna central de DNA en sitios
específicos de ambas cadenas de hélice doble. Estas
enzimas se conocen como endonucleasas de
restricción ó enzimas de restricción.

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El rompimiento es especifico y reproducible. Consiste en deshacer la unión que
forma el grupo fosfato entre dos moléculas de desoxirribosa de la hebra de
DNA.
Las secuencias que la mayor parte de enzimas reconocenmiden de cuatro a
seis nucleótidos y se caracterizan por un tipo particular de simetria interna.
MODIFICACIÓN, PROTECCIÓN DE LA RESTRICCIÓN: Los centros
reconocibles propios están metilados, para no ser atacadas por las mismas
enzimas..
La actividad de las enzimas de restricción depende de unas condiciones
precisas :
a.
pH
b.
Temperatura
c.
Concentración de sal
d.
Iones

•Una unidad enzimática (u)se define como la cantidad de una enzima
requerida para digerir 1 ug de DNA bajo condiciones optimas.
!//(.
/(/+:..!
•Permiten
cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias
!
palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones).

 
 

DNA constante

Enzima en cantidad
decreciente.

Selecciono gen de interés

Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las queson
extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de la bacteria de
donde se aisló por primera vez esta enzima. La primera letra representa el
género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, una cuarta letra
indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de enzimas que se han
aislado de esa cepa. Ej:
Eco RI  E = género Escherichia
co = especie coli
R = cepa RV 13I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

Existen, en general, 3 sistemas de enzimas de restricción:
Tipo 1: Una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de
reconocimiento, restricción (corta) y modificación (metila). Al reconocer la
secuencia específica de DNA corta al azar en sitios distintos al sitio de
reconocimiento. El corte deja extremos cohesivos. Necesitan de ATP para
moverseen el DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte
(unas 1000 pares de bases aproximadamente), además de SAM (S-adenosilmetionina) y Mg++ como cofactores.
Tipo 2: Solo tienen actividad de restricción. Otras enzimas llevan a cabo la
metilación. El corte es efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien, cerca
de él, por lo que el corte es resistente y predecible. Por estacaracterística es
que son muy utilizadas para clonación de genes, ya que al cortar en sitios
específicos se pueden recuperar secuencias conocidas. Sólo requieren Mg++
como cofactor, no necesitan de ATP.

Tipo 3: Se utiliza una enzima oligomérica que realiza todas las actividades
enzimáticas. Tienen función de restricción y modificación. Cortan de 25 a 27
pares de bases lejos del sitio de reconocimiento,dejando extremos
cohesivos. Requieren dos secuencias de reconocimiento en orientación
opuesta en la misma cadena de DNA. Necesitan ATP, Mg++ y SAM (Sadenosil-metionina) como cofactores.
Hay otros sistemas de restricción descubiertos actualmente, como el
sistema tipo 4 de E. coli (Eco571) que consta de una sola enzima que corta
únicamente DNA metilado en una secuencia específica, y que además...