Doctor Biologia

ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO MEDIANTE WESTERN-BLOTTING DE PROTEÍNAS EN GEL DE ACRILAMIDA

Tabla de diferentes % gel separatting para un volumen final de 10mL (volumen para un gel de miniprotean):

% Separatting
Agua (mL)
Acrilamida (mL)
Separatting 2x (mL)
4
3,7
1,3
5
6
3
2
5
8
2,3
2,7
5
10
1,7
3,3
5
12
1
4
5
14
0,3
4,7
5

Para hacer el gel sellador (evita que seescape el gel separatting), se toma una alícuota de 1,5mL de la mezcla de esos 3 componentes y se le añade 5L TEMED+30L APS (al 10%) y se añade inmediatamente al cristal ya que polimeriza enseguida.
Al resto de la mezcla se añade 5L TEMED+100L APS (al 10%) y se añade al cristal. Encima se añade 200L 2-propanol para eliminar las burbujas del frente. Dejar polimerizar 30-45 min (el calor acelerala solidificación del gel).
Posteriormente se retira el propanol del frente y se añade agua destilada para eliminar los restos de solvente.

Encima, se le añade el Stacking, (para 2 geles):

- acrilamida: 0,65ml
- buffer stacking 2X: 2’5ml
- agua destilada: 1,850ml
- TEMED: 2,5 L
- APS (al 10%): 50L

Se añade el stacking hasta arriba y seintroduce peine.
Se deja gelificar durante 20-30 min aproximadamente.

Una vez gelificado, se sacan los cristales de los soportes (la goma de los soportes se impregna de running buffer 1X para que haga el vacío y no se escape tampón de carrera) y se introduce en los soportes de la cubeta de electroforesis, (situando el cristal pequeño hacia dentro).

Una vez colocados los cristales, se rellena detampón de carrera (running buffer) el interior de la cubeta y el espacio entre los cristales hasta la línea de 2 o 4 geles dependiendo del nº de geles que se hayan .

Terminado esto, se empieza a cargar las muestras en los pocillos formados con el peine.

La mezcla de la muestra consiste en:

Un volumen de muestra correspondiente a una cantidad determinada de proteína (100g) similar entodas las muestras a cargar en el mismo gel.
Agua destilada hasta 20L, por ejemplo.
5L de LB5X (loading buffer: tampón de carga).

Esta mezcla se calienta a 95 ºC, 5 min y lo centrifugamos a 10000rpm 30sg.

El LB5X tiene 2 propósitos:

Teñir la muestra para poder ver el frente
Dar densidad a la muestra para que caiga (glicerol).


Condiciones de la electroforesis (carrera):

- para4 geles: - para 2 geles:

150V (voltios) 100V


En uno de los pocillos del gel se puede un patrón de peso molecular (3-4L): PRECISION PLUS PROTEIN STANDARDS #161-0374 DUAL COLOR BIO RAD:

La carrera se deja hasta que el frente llega hasta el gel sellador en la parte.

Ya terminada laelectroforesis, el gel se equilibra en tampón de transferencia (5-7 min). Mientras se pueden cortar la nitrocelulosa (P/N 66485 PALL) junto con papel whatman (extra thick blot paper 1703969 BIO RAD), los cuales se equilibran en tampón de transferencia durante 5 min.

Una vez equilibrado todo, se forma el sándwich, cogiendo una lámina de papel whatman colocada debajo de la nitrocelulosa y sobre éstase coloca el gel y encima otro papel whatman para terminar el sándwich.

Cuando ya está formado, se situa en el TransBlot Semidry (maquina de transferencia semihumeda). Y las condiciones para ésta son: 15V, 100mA (por cada gel) y 1 hora.

Terminada la transferencia, el gel se puede teñir con azul coomassie, y la nitrocelulosa se incuba en rojo Ponceau en agitación (5 min hasta que se tiñabien), y luego se lava bien con agua destilada para quitar el background. Al gel teñido se puede escanear para tener constancia de la carga proteica.

La membrana se lava varias veces con TTBS en agitación para terminar de retirar el color rojo de la misma.

Posteriormente se realiza el bloqueo de la membrana durante 1 hora en agitación orbital (50rpm) a temperatura ambiente (o toda la noche a...