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.1.3. Técnicas de fragmentación y separación de los componentes de las células 

1.1.3.1. Fragmentación celular  
El  fraccionamiento  subcelular  es  un  conjunto  de   métodos  y  técnicas  que 
tienen  como  objetivo  obtener  fracciones  puras  o  enriquecidas  en  un  determinado 
componente  celular,  ya  sea  éste   un  orgánulo  (mitocondrias,  núcleos,  peroxisomas, 
etc.)  una fracción  de  membrana  (membrana  total,  plasmática,  dominio  basolateral, 
dominio  apical,  etc.),  complejos  multiproteicos  (citoesqueleto  de  actina, 
microtúbulos, poros nucleares, etc.). 
Fases: 
● Preanalítica: Obtención preparación preliminar de la muestra hasta llegar al 
laboratorio 
● Analítica: o de aplicación de procedimientos. Toma y tratamiento de datos, recogida de resultados en un informe 
● Postanalítica: Validación técnica del informe analítico. 
 
Todo proceso de fraccionamiento subcelular tiene dos etapas : 
● Rotura de las células o tejidos para obtener un lisado celular (o tisular) en el 
que la fracción deseada se encuentre en condiciones adecuadas para su 
purificación. 
● Separación de la fracción deseada del resto de componentes de la célula o del tejido mediante algún criterio como puede ser una diferencia de densidad 
(centrifugación en gradientes o centrifugación diferencial), la presencia de 
algún antígeno (cromatografía de inmunoafinidad, inmunoprecipitación, etc.). 
Técnicas de rotura de células y tejidos  
El  primer  paso  en  la  purificación  de  la  mayoría  de  las  proteínas  y  estructuras 
subcelulares  es  la  rotura  de  los tejidos o de las células para obtener un lisado celular 
en  el  que  la  proteína,  el  complejo  multiproteico  o  la  estructura  subcelular  se 
encuentre  en  condiciones  que  permitan  su  aislamiento.  Esto  se consigue empleando 
procedimientos  mecánicos  suaves  conocidos  generalmente  como  homogenización. 
Estos  métodos  producen  la  rotura  de  las  membranas  celulares,  suavemente,  con  lo que se libera el contenido celular.  
Los procedimientos de homogenización más comunes son : 
 
La  purificación  de  cada  uno   de  los  principales  organelos  subcelulares 
representó  un  gran  logro  en  la  Biología  celular  al  hacer  posible  el  estudio  detallado 
de sus estructuras y funciones metabólicas.  
 
La  purificación  se  inicia  con  la  rotura  de  la  pared  celular,  de  la  membrana plasmática, o de ambas. Las células deben  estar suspendidas en una solución con pH 
y  concentración  de  sales  apropiada.  Normalmente  se  emplea  sacarosa  isotónica 
(0,25%) o una combinación de sales similar a las de la célula.  
 
El proceso de fraccionamiento consta principalmente de las siguientes etapas: 
1. HOMOGENIZACION  
 
Se  trata  de  romper  las células con la ayuda de un émbolo rotatorio que se ajusta 
perfectamente  a  las  gruesas  paredes  de  un  tubo  de  cristal  especial,  el 
homogenizador.  ​
Células  anexas:  primero  se  deben  romper  conexiones  con  otras 
células.  ​
Células  no  anexas:  ​
pueden  separarse  teniendo  en  cuenta  forma,  densidad  o 
características  que  puedan  marcarse.  Existen  dispositivos  de homogenización en los 

que  está  calibrada la  separación  entre  el  émbolo   y  la  pared  de  cristal  para  producir  
homogenizados   con  un   tamaño  de  partícula  determinado.  Consiste  en  el 
procesamiento  del  tejido   y  posteriormente  de  las  células   con  el  fin  de  obtener  una 
mezcla  fluida en la cual estén todos los componentes celulares, para lo cual podemos 
recurrir a diversos métodos físicos. Homogenizador de Esferas  
Fragmentación celular por acción del choque de las esferas de vidrio con las células.  

 
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Tamaño de esferas: 
 0.1 mm: Bacterias, esporas. 
 0.5 mm: Levaduras, micelio, microalgas, células animales no anexas, células 
tripsinizadas. 
 1.0, 2.5 mm: Cerebro, músculo, piel, hojas. 

 
La  cantidad  de  esferas  debe  ser  al  menos  el  50%  del ...