Dosificación De Proteínas

BIOQUIMÍCA-PRÁCTICO 4

Dosificación de proteínas

1. INTRODUCCIÓN Los métodos de dosificación de proteínas son utilizados para determinar la concentración de proteína de una muestra. Existen diferentes métodos para cuantificar la cantidad de proteína. Para la elección del mismo habrá que tener en cuenta, entre otros: cantidad total de proteína disponible, grado de pureza necesidad deconservar la muestra luego del ensayo, presencia en la muestra de compuestos que interfieran con el ensayo, rapidez con la que se necesite el resultado. Los diferentes métodos de cuantificación de proteínas utilizan la espectrofotometría como técnica de cuantificación. Los métodos de cuantificación de proteínas pueden dividirse en dos categorías: directos e indirectos.
- Métodos Directos: basados en laabsorción propia de las proteínas:

absorción en el ultravioleta absorción debida a grupos prostéticos de las proteínas (si los hay)
- Métodos Indirectos: basados en la absorción que resulta de la interacción de las proteínas con reactivos

específicos: con el reactivo de Biuret con el reactivo de Lowry con el ácido bicinconínico (BCA) con el reactivo de Bradford 1.1. Métodos Directos1.1.1. Absorción en el ultravioleta Las proteínas contienen ciertos enlaces o aminoácidos cuyos grupos funcionales absorben luz en el ultravioleta (UV) y por lo tanto pueden ser utilizados para cuantificar la concentración de proteína por espectrofotometría. Absorbancia a 280 nm En la Tabla 1 se muestran los picos de absorción en el ultravioleta de los aminoácidos aromáticos triptófano (Trp), tirosina(Tyr) y fenilalanina (Phe) asi como del enlace entre cisteínas llamado también cistina (Cys-Cys). Por otra parte, el enlace peptídico en sí mismo presenta un máximo de absorbancia a 190 nm. Si observamos el espectro de absorción en ultravioleta del Trp y la Tyr podemos ver que ellos absorben en mayor o menor medida a 280 nm (Figura 1).

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Dosificación de proteínasTabla 1. Absorción de proteínas en el UV Máximo de absorción Cromóforo (nm) Triptófano (Trp) Tirosina (Tyr) Fenilalanina (Phe) Cistina (Cys-Cys) Enlace peptídico
Figura 1. Espectro de absorción del Trp, Tyr y Phe.

280 275 257 250 190

Esta propiedad permite determinar la concentración de proteínas midiendo las unidades de A280 presentes en la muestra proteica. Podemos encontrar la utilizacióndirecta de dicho valor de A280 para dar idea de la concentración de proteínas. Por ejemplo, puede encontrarse expresiones tales como “solución de seroalbúmina de 0.4 unidades de A280”. Para una muestra de proteína pura de la cual se conoce la secuencia de aminoácidos es posible determinar su coeficiente de extinción molar teórico utilizando diferentes programas disponibles libremente comoweb.expasy.org/cgi-bin/protparam/. Conocido dicho coeficiente, se puede determinar la concentración molar (M) de la solución aplicando la relación de Lambert-Beer vista en la práctica 1: Abs= ε.c.b Ejemplo: supongamos que se quiere determinar la concentración de una solución de Lisozima de clara de huevo al 0,1% (es decir a 1g/L) cuya Abs 280 nm es de 0,878. Sabiendo que el coeficiente de extinción molar dela Lisozima es de 37970 M-1 cm1 se va a la ecuación de Lambert-Beer y se despeja la concentración : Abs= ε.b.C C = Abs / ε.b

Sabiendo que el camino óptico (b) es de 1cm, se puede calcular la concentración proteica (C). C= 0,878 / 37979 M-1 cm-1 x 1 cm = 2,31 x10-5 M Este valor se puede expresar en μM CLisozima = 23,1 μM

Absorbancia a 205 nm La medida de la A205, longitud de onda cercana almáximo de absorbancia del enlace peptídico = 190 nm, es especialmente útil para medir concentraciones de proteínas o péptidos que no contienen Trp, Tyr o Cys-Cys. Este método tiene el inconveniente de que muchos compuestos que frecuentemente están presentes en las preparaciones de proteínas absorben luz a esta longitud de onda. Se utiliza mucho para seguir cromatografías de purificaciones de...