Dot Blot


OBJETIVO GENERAL
Aprender a detectar biomoleculas por medio de la tecnica llamada Dot Blot

OBJETIVO ESPECIFICO
Detectar IgG humana anti Virus de la influenza y Rotavirus mediante elinmunoensayo dot blot

FUNDAMENTO

Una mancha de puntos (o dot blot) es una técnica en biología molecular para detectar biomoléculas. Se representa una simplificación de la transferencia Northern,Southern blot, o métodos de western blot. En un dot blot las biomoléculas para ser detectados no se separan primero por cromatografía. En su lugar, una mezcla que contiene la molécula a ser detectada seaplica directamente sobre una membrana como un punto. Esto es seguido por la detección por cualquiera de las sondas de nucleótidos (para una transferencia de Northern y Southern blot) o anticuerpos (paraun western blot).

MATERIALES Y EQUIPOS
Equipos de dot blot

Tapa inferior
Membrana selladora de silicona
Papel filtro
Membrana de nitrocelulosa
Tapa superior
Reservorio de bufferAjuste de los tornillos
Fuente de poder



PROCEDIMIENTO

1. En una menbrana de 1cm x 2cm agregar 5µL de cada antígeno y secar a temperatura ambiente por 1 hora.

Ag1: proteína recombiante (MI)contra el virus de la influenza
Ag2: proteína recombinante (VP4) contra el rotavirus.

2. Bloquear membrana adicionando una solución bloqueadora (leche descremada libre de grasas al 5% con TBS-Tcon un pH de 7.5) e incubar a 37°C por 1 hora con agitación constante.
3. Preparar 2mL de suero humano en una dilución 1:50
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5. Incubar 30 minutos con agitación constante.
6. Retirar el sueroy lavar tres veces con 3mL de TBS-T (5 minutos cada lavado).
7. Adicionar el conjugado.
8. Incubar 30 minutos con agitación constante.
9. Retirar el conjugado y lavar la membrana 3 veces con TBS-T(5 minutos cada lavado).
10. Adicionar a la membrana 300µL del sustrato TMB (3, 3’, 5, 5’-tetramethyl benzidine) y dejar actuar de 2-5 minutos
11. Detener la reacción lavando la membrana 3 veces...