DOT BLOT


Introducción.
El Dot Blot es un método de aplicación de las proteínas directamente sobre una membrana, una muestra disuelta se tira a través
la membrana o bien por aplicación de un vacío , laabsorción o la intrusión ; las proteínas se unen a la membrana y estas están entonces disponibles para el análisis y mediante anticuerpos especifico pueden ser detectadas. Esta técnica se puede utilizarcomo un método cualitativo para la detección rápida de un gran número de muestras, es una prueba de diagnóstico económica y de fácil ejecución en laboratorios de baja complejidad, el antígeno se fijacon una fase sólida, generalmente papel de nitrocelulosa. Dot blot es sensible, específica y fácil de realizar porque no requería equipo sofisticado para su ejecución y lectura.

Materiales.
1.Membrana de Nitrocelulosa de 3 cm x 1 cm con tamaño de poro .45 micras







2. 5 microlitros de M1 del Virus de Influenza y 5 microlitros de proteina VP4 de Rotavirus
3. Solución bloqueadora(Leche descremada 5% + TBS Buffer Salino de Tris adicionado con Tween 20 al .05% en un pH 7.5)
4. Suero de personas entre 18-20 años
5. TBS-Tween 20
6. Conjugado (Peroxidasa de rabano + Proteina A)*Proteina A: Proteína en la membrana de S. Aureus, reconoce IgG en su región Fc.
7. Sustrato de TMB (Tetramethylbenzidine)







Metodología.
1. Usamos una membrana de nitrocelulosa de3cm x 1cm con tamaño de poro de .45 micras y agregamos dos Ag:
a) 5 microlitros de proteína M1 (matriz) del Virus Influenza
b) 5 microlitros de proteína VP4 del Rotavirus

2. Depositamos y se dejasecar la membrana a temperatura ambiente por lo menos 1 hora.
3. Adicionar a las membranas una solución bloqueadora ( Leche descremada 5% + TBS Buffer Salino de Tris adicionado con Tween 20 al .05%en un pH de 7.5) por una hora en agitación (37°c/Temperatura ambiente).
4. Preparar una dilución de 1:50 de suero problema en un volumen de 2 ml.
1 ml- 50 microlitros TBS-T
x - 2000...