DTERMINACION DE FOSFATASA RESIDUAL

 Determinación de fosfatasa residual
La fosfatasa es una enzima normalmente presente en la leche cruda. En las condiciones ordinarias de pasteurización (lenta, rápida o ultrarápida) la enzima se inactiva. Se ha demostrado que esta enzima es más difícil de destruir que la mayoría de los organismos patogénicos termo-resistentes que pudieran estar presentes en la leche, como por ejemplo el bacilotuberculoso. La prueba es de gran utilidad para decidir si la leche ha sido o no pasteurizada, si la leche pasteurizada se ha mezclado con leche cruda, o incluso si la pasteurización ha sido deficiente.

2.1. Principio del método.
La muestra se incuba con fenilfosfato en solución reguladora de hidróxido de bario. Si la fosfatasa activa está presente, el fenilfosfato se hidroliza y se formafenol.
C6H5OPO3H2 + H2OC6H5OH + H3PO4
Si la leche utilizada en la elaboración del producto ha sido pasteurizada eficientemente, la fosfatasa se destruye y no hay hidrólisis.
El fenol formado se determina colorimétricamente haciendo reaccionar con 2,6-Dibromoquinonaclorimida (B.Q.C.) obteniéndose un color azul, cuya intensidad se mide espectrofotométricamente a 610 nm.
Equipo.
-Baño de agua concontrol de temperatura a 37- 40°C.
-Parrilla de calentamiento, de control termostático.
-Espectrofotómetro de UV-Visible o fotocolorímetro disponible para utilizarse a 610 nanómetros con celdas de 1 cm de paso óptico.
- Balanza analítica con una precisión de 0,1 mg.
Materiales.
Todo el material de vidrio utilizado debe someterse a una temperatura entre 85-90°C durante una hora.
-Tubos deensaye de 15 x 160 mm
-Tubos de ensaye con graduación de 0 a 10 mL.
-Pipetas graduadas en 0,1 mL de 1, 5 y 10 mL
-Embudos de filtración, tallo corto, de 5 cm de diámetro.
-Matraces volumétricos de diferentes capacidades.
-Papel filtro Whatman No. 42 o No. 2 o su equivalente.
-Material común de laboratorio.
-Perilla de succión.
Reactivos.
Los reactivos que a continuación se mencionan deben serde grado analítico y libres de fenol a menos que se indique otra especificación y por agua debe entenderse agua destilada.
-Hidróxido de bario octahidratado [Ba(OH)2 . 8 H2O].
- Acido bórico (H3BO3).
-Metaborato de sodio (NaBO2).
-Cloruro de sodio (NaCl).
- Borato de sodio decahidratado (Na2 B4O7 . 10 H2O).
-Fenilfosfato disódico (C6H5Na2O4P.2H2O). Cristales libres de fenol. Conservar encongelación o en desecador.
- Alcohol butílico (C4H10O). Punto de ebullición 116-118°C.
-Sulfato de zinc heptahidratado (Zn SO4 . 7 H2O).
- Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 . 5 H2O).
-Alcohol etílico (C2H5OH).
-Fenol (C6H6O).
-Solución reguladora de hidróxido de bario-borato (pH 10,6 ± 0,15 a 25°C).
Disolver en agua caliente 25 g de hidróxido de bario octahidratado (fresco, nodeteriorado) y diluir a 500 mL. Por separado, disolver 11 g de ácido bórico en agua y diluir a 500 mL. Calentar cada una de las soluciones a 50°C, mezclarlas, agitar y enfriar aproximadamente a 20°C. Filtrar y conservar el filtrado en recipiente perfectamente tapado y en refrigeración.
-Solución reguladora de borato-hidróxido de bario (18:8 m/v). únicamente para mantequillas.
Disolver en agua caliente 18g de hidróxido de bario octahidratado (fresco, no deteriorado) y diluir a 500 mL. Por separado, disolver 8 g de ácido bórico en agua caliente, enfriar y diluir a 500 mL. Calentar cada una de las soluciones a 50°C, mezclarlas, agitar y enfriar aproximadamente a 20°C. Filtrar y conservar el filtrado en recipiente perfectamente tapado y en refrigeración.
--Soluciones reguladoras de trabajo confenil fosfato disódico.
-Para quesos y cremas pasteurizadas.
Disolver 0,1 g de fenil fosfato disódico en 50 mL de solución de borato-hidróxido de bario (2.4.12) y 50 mL de agua, mezclar bien. Conservar en frasco color ámbar y en refrigeración.
- Para mantequillas.
Disolver 0,1 g de fenil fosfato disódico en 100 mL de solución de borato-hidróxido de bario (2.4.13) y 50 mL de agua, mezclar bien....