Duplicated P5Cs Genes Of Arabidopsis Play Distinct Roles In Stress Regulation And Developmental Control Of Proline Biosynthesis

Duplicated P5CS genes of Arabidopsis play distinct roles in stress regulation and developmental control of proline biosynthesis


Introducción:
La acumulación de prolina es una respuesta fisiológica ante el estrés osmótico. La prolina actúa como chaperona molecular estabilizando la estructura de las proteínas, regulador del potencial redox celular y como controlador de los niveles deradicales libres. Su biosíntesis está catalizada por la enzima D-1-pirrolina-5-carboxilato sintetasa (P5CS) que es codificada por dos genes P5CS estrechamente relacionados en Arabidopsis. La actividad de esta enzima es un paso limitante en la biosíntesis de prolina, y es controlada a nivel de transcripción mediante inhibición de la retroalimentación de los P5CS por prolina.
Procedimientos y resultados:El material vegetal del cual se parte para hacer los experimentos ha tenido un crecimiento en cultivos estériles y cámaras controladas. La transformación de las plantas se realiza mediante infiltración de Agrobacterium. Los tratamientos de estrés salino se llevaron a cabo en plantas de:
-3semanas, cultivo in vitro, incubadas en medio 0,5MS líquido (10ml) con 150-200mM de NaCl.
-6semanas,cultivo en cámara de crecimiento, transferencia a cultivo hidropónico con solución Hoagland que contenía NaCl.
La sequía se impuso en plantas de 6semanas, que crecen en suelo con retirada de agua durante 10días.

En primer lugar se realiza una caracterización de mutantes p5cs1. Se utilizaron cuatro mutaciones de inserción p5cs1. La transcripción de los alelos mutantes se caracterizó por RT-PCRsemicuantitativa (20-35 ciclos) tomando ARN aislado en plantas de 2 semanas sin sal y en presencia de 200mM de NaCl durante 24h. Se utilizaron parejas de primers de genes específicos y combinaciones tanto para 5’ como 3’; obteniendo como resultados un nivel bajo de transcripición en los mutantes tratados con sal p5sc1-1 y 1-3 (con inserciones de T-DNA en la región 5’lider y el intrón 3, respectivamente)por lo que representan alelos knock-down en lugar de mutaciones knock-out, lo que permite la síntesis residual y la maduración de ARNm.
A continuación, se observa cómo puede estar afectada la acumulación de prolina en estés en los mutantes. En condiciones de crecimiento normales se observa un menor contenido de prolina libre en plantas p5cs1 de 6 semanas cultivadas en suelo, en comparación conlas de tipo silvestre. Esta disminución indica la contribución de P5CS1 en la síntesis de prolina. Cuando exponemos a las plantas in vitro, salvajes y mutantes, a tratamientos con 200mM NaCl durante 48h, el resultado es que los niveles de prolina se multiplicaron por siete en las salvaje y por dos en las mutantes. Y de igual manera sucede cuando se expone a la planta a estrés por sequía. Estadiferencia indica que la deficiencia de P5CS1 no fue compensada por P5CS2 y que P5CS1 tiene un papel fundamental en la regulación de la acumulación de prolina en estrés salino y por sequía. También es importante la observación de que la reducción notablemente mayor del contenido de prolina en mutantes ante la sequía no se tradujo en grandes diferencias en el contenido relativo de agua (CRA) entreplantas salvajes y mutantes.
Para evaluar los efectos de las mutaciones p5cs1 en el crecimiento de las plantas bajo estrés salino, se realizan ensayos comparativos de germinación, elongación de las raíces, el crecimiento de las plántulas y la inducción de la clorosis utilizando plantas cultivadas de tipo salvaje y p5cs1, en la ausencia o presencia de 150-200mM de NaCl .Las tasas de germinación fueronsimilares en todas las condiciones. Sin embargo, la tasa de crecimiento de las raíces y el desarrollo de las hojas:
-Control: similar en silvestre y mutante
-150 mM NaCl: menor en mutantes
-200mM NaCl: mucho menor en mutantes
Además en tratamiento con sal los mutantes p5cs1 tienen una mayor clorosis por aumento de daño oxidativo por mayor especies reactivas al oxígeno (ROS) (doble de H2O2...