Ech 42

La sobre-expresión, purificación y caracterización de los
Trichoderma atroviride endochitinase, Ech42, en Pichia pastoris
Resumen
El gen endochitinase ech42 de atroviride Trichoderma fue clonado y expresado enPichia pastoris utilizando una expresión constitutiva del sistema. Más del 98% de la proteína recombinante se excreta en el medio de cultivo como glicoproteína. Una concentración alta endochitinase, 186 mg / L con una actividad enzimática específica de 14.128 U de 1 mg fue producida. El óptimo de los parámetros cinéticos de la enzima recombinante de
proteínas eran idénticos a los reportados para la enzima aislada de T. atroviride. El endochitinase recombinante posee adecuadas características para algunas aplicaciones biotecnológicas, como la actividad a pH ácido y termoestabilidad.Introducción
Después de celulosa y lignina, quitina es considerado uno de los polisacáridos más abundantes en la naturaleza, con una producción
de 1011 toneladas al año como componente estructural de varios
organismos como los hongos e invertebrados [1,2]. Sus derivados
como el diacetil-chitiobiose y N-acetilglucosamina
tienen un significativo valor económico  e importantes aplicaciones biotecnológicas. Las tecnologías basadas en la utilización
de los derivados de la quitina sacan provecho de su
propiedades polielectrolitas , tales como la presencia de 
grupos funcionales reactivos, su capacidad de formación de gel, de su gran capacidad de adsorción [3], la biodegradabilidad, bacteriostático, fungistático,
y las propiedades antitumorales [4-7].Quitinasas (EC 3.2.1.14; 1,4-b-poli-N-acetilglucosaminidasa) hidrolizar el b-1, 4 vinculación de la quitina [1,8,9].
De acuerdo con el mecanismo de reacción que se clasifican
como exochitinases, endochitinases y chitobiosidases o Nacetyl glucosaminidases [8] y son producidas por una variedad amplia  de organismos incluyendo bacterias, hongos y mamíferos [10-13]. Para el diseño de bioprocesos con menos impacto en
el medioambiente, endochitinases se han propuesto para
la hidrólisis enzimática de la quitina, en lugar de los comunes
procesos químicos.
Atroviride Trichoderma es un hongo común del suelo utilizado como
un agente de control biológico debido a su capacidad de parasitar
hongos fitopatógenos. El mecanismo utilizado por Trichoderma
para atacar a su anfitrión, consistió en la producción de pared celular
deenzimas degradantes, incluidas las quitinasas, ha merecido
por lo menos una década de estudios [14]. Entre las quitinasas producidas
por atroviride T., el endochitinase, Ech422, tiene una alta capacidad hidrolítica sobre la pared celular de hongos varios,
por lo tanto se ha considerado una enzima clave en el biocontrol eficaz de este micoparásito.  Ech42 ha sido bien caracterizadaa nivel genómico y a  nivel proteico  [15], mostrando deseables
características catalíticas para aplicaciones industriales y de control biológico.
La levadura Pichia pastoris metilotrófica, ha sido
utilizada para la expresión de muchas proteínas con la perspectiva biotecnológica [16]. Pichia pastoris tiene varias ventajas
con respecto al sistema de expresión de otros: (i) el crecimiento de alta
velocidad ala alta densidad de células (ii) la utilización de medios de cultivo simples
y (iii) la proteína recombinante se pueden exportar al
medio de cultivo para facilitar el proceso de recuperación de proteínas.
En este estudio, un sistema de P. pastoris constitutiva se utilizó para la expresión de Ech42 atroviride T..

Materiales y métodos
Materiales
Cepa de Escherichia coli TOP10F0 (Invitrogen) seutilizó
para la rutina de  amplificación del plásmido .  Plásmido pGAPZaA,
Zeocine para la selección de transformantes, P. pastoris
Cepa SMD1168H, EcoRI, PstI y XbaI, la restricción
enzimas fueron adquiridas de Invitrogen. AvrII fue
obtenido a partir de New England Biolabs y T4 ADN ligasa
de Promega. Taq polimerasa y los reactivos para la PCR 
así como de una sola cadena de...