EFECTO Y VERIFICACION DE LA CONCENTRACION DE SUSTRATO EN REACTIVOS COMERCIALES

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Laboratorio de Sistemas de Control de calidad

PRACTICA NO. 8
EFECTO Y VERIFICACION DE LA CONCENTRACION DE SUSTRATO EN REACTIVOS COMERCIALES

5QM1
México DF 2012



Introducción
Las enzimas son proteínas que actúan como catalizadores biológicos. Un catalizador aumenta la velocidad de una reacción química sintomar parte de ella, reduce la energía de activación para una reacción y hace que la reacción vaya más rápido en ambas direcciones; la principal característica que diferencia a la enzima de los catalizadores inorgánicos es su alta especificidad, pues actúan en una reacción o en un grupo de reacciones que tienen sustratos semejantes o relacionados estructuralmente.
La enzimología clínica havenido evolucionando rápidamente, hace 30 años representaba de 3 a 5% de la carga de trabajo en los laboratorios, mientras que ahora ocupa de 20 a 25%. El rápido florecimiento fue debido a que toda una generación de bioquímicos se dedicó a asilar, identificar y caracterizar las enzimas tisulares, desarrollando simultáneamente métodos y aparatos para efectuar las mediciones con alta calidad y bajocosto. En el suero se han identificado más de 50 enzimas celulares relacionadas con alguna enfermedad pero son 15 las enzimas que se utilizan de manera casi rutinaria.
La presencia de una enzima se detecta porlas reacciones específicas que cataliza. Toda reacción enzimática puede esquematizarse como sigue:


Así, la enzima se combina con un sustrato (S) que se transforma en un producto (P).El tiempo que tarda una determinada cantidad de S en transformarse en P es lo que caracteriza a la enzima, y se denomina velocidad o actividad enzimática (v) que se define como cantidad de sustrato transformado o de producto formado en la unidad de tiempo y se expresa en se expresa en UI (mmol/min/L).
Para muchas enzimas, la velocidad de catálisis, v, varía con la concentración de sustrato (S)en la forma que muestra:






Los métodos más comunes de valoración de enzimas son:
a) Volumétricos, cuando en la reacción enzimática se consume o se produce un producto gaseoso.
b) Colorimétricos, cuando el producto formado es coloreado o da color en una reacción posterior (por ejemplo en la valoración de la fosfatasa alcalina).
c) Espectrofotométricos, para aquellas reaccionesenzimáticas que utilizan NAD (P) o NAD(P)H como coenzimas.
d) Radiométricos, utilizando un sustrato marcado radiactivamente.
Objetivo
Estudiar la actividad de la fosfatasa alcalina y aplicar los conceptos de calidad aprendidos durante el curso, para interpretar los resultados de acuerdo a control de calidad, así como establecer la importancia de la km para calcular la concentración de sustrato yde reactivo.
Fundamento
La determinación de la fosfatasa alcalina se realiza a partir de un método colorimétrico en donde el p-nitrofenilfosfato en presencia de agua y la enzima fosfatasa alcalina da como producto la formación de fosfato y p-nitrofenol. La reacción se realiza a temperatura controlada.
Metodología
Preparar una serie de tubos con diluciones del sustrato con la soluciónreguladora.











Tiempo
(min)
Sin
dilución
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
1:128
1:256

Abs
Δ
Abs
Δ
Abs
Δ
Abs
Δ
Abs
Δ
Abs
Δ
Abs
Δ
Abs
Δ
Abs
Δ
1
0.782
0
0.329
0
0.32
0
0.23
0
0.228
0
0.711
0
0.147
0
0.1
0
0.145
0
2
0.793
0.011
0.33
0.001
0.328
0.008
0.234
0.004
0.233
0.005
0.712
0.001
0.155
0.008
0.1
0
0.145
0
3
0.8010.008
0.338
0.008
0.339
0.011
0.238
0.004
0.235
0.002
0.713
0.001
0.157
0.002
0.1
0
0.143
0.002
4
0.812
0.011
0.347
0.009
0.344
0.005
0.242
0.004
0.238
0.003
0.714
0.001
0.152
-0.005
0.099
0.001
0.143
0
5
0.822
0.01
0.357
0.01
0.351
0.007
0.246
0.004
0.242
0.004
0.714
0
0.153
0.001
0.099
0
0.143
0
6
0.832
0.01






0.245
0.003...