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Páginas: 3 (600 palabras) Publicado: 4 de abril de 2013
NMUNOPRECIPITACIÓN
La base de esta técnica consiste en concentrar al máximo la proteína de
interés para posteriormente desarrollar el immunoblotting, de tal forma que el número
de bandasinespecíficas obtenidas por esta técnica disminuye considerablemente.
En el tejido homogeneizado vamos a tener el antígeno de interés mezclado
con otros muchos. Para poder concentrarlo, primero se añadeel anticuerpo primario a
una concentración saturante, para que todo el antígeno presente en el tejido se una
al anticuerpo (fase de inmunoabsorción). Después de la incubación con el anticuerpoprimario se realiza una segunda fase en la que se añade proteína G, que está unida a
sefarosa. La proteína G es una proteína de la pared celular de Streptococcus que une
la fracción constante (Fc)de las inmunoglobulinas G (IgG) con gran afinidad. Además
del receptor para la Fc, también tiene sitios de unión específicos para la albúmina y
para la fracción ab (Fab) de las inmunoglobulinas. Laproteína G está unida a la
sefarosa a través del extremo amino terminal y el grupo ε-amino de la lisina. La sefarosa
confiere un carácter insoluble al complejo proteína G/sefarosa, con lo queresulta fácil
separarlos por centrifugación. 2
Y Anticuerpo primario
Proteína G conjugada
con sefarosa
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Inmunoabsorción
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
YY
Y
Y Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Proteína
G/sefarosa Centrifugación 3
 Lavado de la proteína G1
: (Protein G Sepharose®, Fast Flow Streptococcus sp.
Sigma: P-3296)
1.Lavar el conjugado de agarosa dos veces en tampón de lavado (Hepes 20
mM, pH 7.5, NaCl 150 mM, Tritón X-100 al 0,1%, glicerol al 10%) centrifugando
durante diez minutos a 12000 rpm a RT. Descartar elsobrenadante.
2. Resuspender el conjundo en tampón de lavado para que quede una
suspensión de agarosa del 50% del volumen total.
 Incubación con el anticuerpo primario:
1. Calcular la...
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