Ejercicios Resueltos Biología Molecular

Guía de problemas de Biología Molecular
Clonado, transformación, PCR e hibridación.

1)
Se desea clonar en el sitio EcoRI del pUC19 un inserto de 800pb cortado con la misma enzima de restricción. Para esto se trata el vector con EcoRI y se realizan las reacciones de ligación correspondientes. Los resultados de las transformaciones se indican a continuación:

i- Mezcla de ligacióncompuesta por buffer, enzima T4 DNA ligasa, vector cortado (100 ng) y el inserto (300 ng): 967 colonias azules y 2 blancas.
ii- Mezcla de ligación conteniendo buffer, enzima T4 DNA ligasa, y sólo vector cortado (100 ng) : 962 colonias azules.
iii- Vector cortado (100 ng) : 914 colonias azules.
iv- Vector sin cortar (2 ng): 1200 colonias azules.
v- Sin ADN : no se encontraron colonias.

En las placasde Petri (todas conteniendo Ampicilina, IPTG y X-Gal) se sembraron 100 μL del mL total de células transformadas.

a) Indicar qué controles representan los ítems ii-v y qué información se puede obtener de cada uno de ellos.
b) Calcular la eficiencia de transformación
c) ¿Por qué se obtuvieron tantas colonias azules en el ítem I?
d) Se realiza una minipreparación de plásmidos de una coloniaazul y otra blanca de la transformación anterior. A continuación se hace un gel de agarosa, obteniéndose el siguiente resultado:














-¿Cómo se explica que la diferencia en la migración de los plásmidos no sea 800 pb?
-¿Cómo haría para estar seguro de que clonó el inserto correcto?




RESPUESTA:

a) Control ii : Este es un contro de religado. Se obtiene informaciónde cuántos plásmidos se van a religar. En teoría, este número no debería ser alto, ya que necesitamos tener más cantidad del plásmido recombinante que del plásmido original. En este caso, el número de colonias es alto, por lo que se deduce que hubo una gran cantidad de plásmidos que se religaron. Esto puede ser causa, por ejemplo, de no haber agregado Fosfatasa alcalina como paso posterior a ladigestión del plásmido. (De esa manera se logra la eliminación de los grupos fosfato de los extremos cortados del plásmido y por consiguiente la no religación de los mismos.

Control iii : Este sería un control de digestión, que en este caso nos estaría indicando que hubo un problema en el proceso ya que se detectan alta cantidad de colonias azules. Esto nos indica que la enzima de corte no fueeficiente en el proceso de corte. Puede ser por diversos motivos :
-No haber trabajado a la temperatura óptima de la enzima.
-Tiempo de digestión incorrecto.
-Enzima ineficiente por desgaste.
-Utilización de otro buffer.
-Poca cantidad de enzima.

Control iv : Este es el control de la eficiencia de transformación. Aquí se nos da una idea de la cuanto plásmido ingreso en las células, si lasmismas son eficientemente competentes. Aquí se espera que haya un número alto de colonias transformadas para una alta eficiencia.

Control v : Control negativo. No debería haber colonias ya que no hay material genético. Si este control nos llegara a dar positivo, se detecta una contaminación en la placa.

b)

Eficiencia Transf : UFC / μg DNA = 1200 / 2 x 10-3 = 600000

c)
Se obtuvouna gran cantidad de colonias azules en el ítem i a causa de la gran cantidad de vector sin digerir y religado. Tenemos dos poblaciones de plámido original: La formada por religación del mismo y la formada por el vector que nunca se corto.

d)
- Esta diferencia en la migración se debe a que los plásmidos no son círculos perfectos cuando están activos, sino que poseen superenrollamiento. Y estees un factor clave a la hora de migrar en un gel de separación ya que debido a la forma que posee va a migrar más o menos. En este caso el plásmido que tiene el inserto , va a migrar más que el que no lo posee, pero no necesariamente 800 pb exactas ya que la migración también depende de la forma.
- Se debe cortar el plásmido con la enzima de restricción utilizada (en este caso EcoRI) y correrlo...